高氟對成釉細(xì)胞生物學(xué)特性影響的體外研究.pdf

1、地方性氟中毒是我國危害最嚴(yán)重的地方病，主要侵犯牙齒和骨骼，造成氟斑牙和氟骨癥，嚴(yán)重危害人的健康和美觀。氟斑牙是慢性氟中毒早期最常見的癥狀，產(chǎn)生氟斑牙最主要的原因是機(jī)體在釉質(zhì)發(fā)育期間長期攝入了過量的氟，導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育障礙。其臨床表現(xiàn)為同一時(shí)期萌出的牙齒釉質(zhì)上出現(xiàn)白堊色到褐色的斑塊，嚴(yán)重者有釉質(zhì)缺損。研究表明，氟離子可以通過多種途徑影響成釉細(xì)胞，包括細(xì)胞的增殖、凋亡，釉基質(zhì)蛋白的合成和分泌，以及蛋白酶活性等。然而，氟離子對不同分化階段的成釉細(xì)

2、胞作用是否一致，其作用機(jī)理是什么尚不清楚。
　　本研究選擇小鼠成釉細(xì)胞樣細(xì)胞系LS8作為研究對象，用視黃酸和地塞米松誘導(dǎo)LS8細(xì)胞建立體外成釉細(xì)胞的分化模型。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測兩種釉基質(zhì)蛋白和兩種蛋白酶的mRNA的表達(dá)水平，熒光標(biāo)記的白蛋白檢測細(xì)胞內(nèi)吞功能，DND-167染料檢測細(xì)胞內(nèi)pH值等多種方法，比較誘導(dǎo)組細(xì)胞和對照組細(xì)胞的各種生物學(xué)特性的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，誘導(dǎo)組細(xì)胞釉原蛋白和釉蛋白的表達(dá)分別下調(diào)了64％和6

3、1.1％（P<0.05），Mmp20和Klk4mRNA的表達(dá)分別上調(diào)了1.42倍和2.41倍（P<0.05）；誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)吞的白蛋白的平均熒光強(qiáng)度為對照組的1.6倍（P<0.05），誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)檢測酸性pH的平均熒光強(qiáng)度為對照組的1.9倍（P<0.05），以上這些特征表明視黃酸和地塞米松誘導(dǎo)的LS8細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化期成釉細(xì)胞的特征，利用對照組和誘導(dǎo)組的LS8細(xì)胞可分別模擬成釉細(xì)胞的分泌期和轉(zhuǎn)化期的研究模型。
　　為了研究高氟對成釉細(xì)胞

4、生長和增殖的影響，本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的氟離子對LS8細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)隨著NaF濃度的增高，LS8細(xì)胞的增殖活性降低，這種作用在NaF作用72h時(shí)更為明顯。當(dāng)NaF濃度達(dá)到2mmol/L時(shí)，加氟后24h和48h細(xì)胞死亡率分別為30％和49％，而當(dāng)NaF作用細(xì)胞72h，0.5mmol/L的濃度就可以引起37％的細(xì)胞死亡，說明毫摩爾劑量的氟離子會(huì)抑制成釉細(xì)胞的增殖。由此，我們確定了本研究高濃度氟離子的具體濃度為2mmol/L

5、。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，視黃酸/地塞米松誘導(dǎo)組（20.43％）和NaF誘導(dǎo)組（19.01％）凋亡細(xì)胞（包括早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞）和死亡細(xì)胞的總比例均比對照組（14.23％）高（P<0.01），而RA/DEX+NaF+誘導(dǎo)組（10.83％）細(xì)胞凋亡/死亡則較對照組有所減少（P<0.01）。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確測量懸浮細(xì)胞的活性，我們利用流式細(xì)胞儀來計(jì)數(shù)培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，RA/DEX+NaF+誘導(dǎo)組懸浮細(xì)胞數(shù)目最多，約為對照組的4.25倍（P

6、<0.01）；同時(shí)采用掃描電鏡觀察這些細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)RA/DEX+NaF+誘導(dǎo)組細(xì)胞失去了正常細(xì)胞的表面形態(tài)特征，細(xì)胞表面褶皺消失而變平，多數(shù)細(xì)胞傾向于連成一片，且其細(xì)胞平均直徑較對照組顯著變小（P<0.01）。通過以上結(jié)果我們認(rèn)為高濃度的氟離子影響成釉細(xì)胞的生物學(xué)特性，如增殖和死亡，并且對轉(zhuǎn)化期成釉細(xì)胞的作用更為明顯。
　　內(nèi)吞作用是成熟期成釉細(xì)胞的重要特征，內(nèi)吞功能異常在氟斑牙的發(fā)生中扮演著重要的角色。那么高氟對

7、不同分化階段的成釉細(xì)胞的內(nèi)吞功能有何影響？為此，我們設(shè)計(jì)了吞噬實(shí)驗(yàn)，利用活細(xì)胞工作站動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的吞噬活動(dòng)，RA/DEX和NaF誘導(dǎo)組細(xì)胞發(fā)生吞噬作用的細(xì)胞數(shù)多于對照組（10個(gè)和21個(gè)vs.6個(gè)），并且吞噬活動(dòng)速度更快。RA/DEX+NaF+誘導(dǎo)組細(xì)胞發(fā)生吞噬作用的細(xì)胞數(shù)最多，80％以上的細(xì)胞都發(fā)生了吞噬作用，并且其吞噬速度在四組細(xì)胞中最快，絕大多數(shù)細(xì)胞都在15min內(nèi)開始了吞噬活動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)說明高濃度的氟離子可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化期成釉細(xì)胞的吞噬

8、功能。
　　目前還沒有有力的證據(jù)表明存在特異的氟離子通道，一般認(rèn)為，氟離子是通過氯離子通道來進(jìn)出細(xì)胞的，那么氟對成釉細(xì)胞生物學(xué)特性的影響是否也是通過氯離子通道來完成的呢？為了驗(yàn)證這一假說，首先我們確定了LS8細(xì)胞中存在的氯離子通道類型；RT-PCR結(jié)果表明，成釉細(xì)胞表達(dá)8種ClC家族氯通道（Clcn1～7，Clcnkb），不表達(dá)Cftr。我們用2mmol/L的氟離子誘導(dǎo)LS8細(xì)胞后，通過實(shí)時(shí)定量PCR篩選對氟離子敏感的ClC家族氯

9、通道，作用時(shí)間為24h和48h時(shí)，各型ClC通道的表達(dá)均有所增高，而當(dāng)作用時(shí)間延長為72h，Clcn1、Clcn3和Clcn7三型ClC通道的表達(dá)分別增加了3.0倍、2.9倍和2.3倍（P<0.05）。通過細(xì)胞內(nèi)pH檢測，作用時(shí)間為24h、48h和72h時(shí)，反映細(xì)胞內(nèi)酸性pH的平均藍(lán)色熒光強(qiáng)度分別為對照組細(xì)胞的2.4倍、2.6倍和2.0倍（P<0.01），通過大量查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)，ClC-3和ClC-7與細(xì)胞內(nèi)酸性pH的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，由

10、此，我們推斷Clcn3和Clcn7可能對氟離子的作用更為敏感，其具體的機(jī)理我們將在下一步的研究中闡明。
　　通過本研究，我們建立了研究氟離子對成釉細(xì)胞影響的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察到了高濃度的氟離子對轉(zhuǎn)化期成釉細(xì)胞作用更為敏感，發(fā)現(xiàn)氟離子通過干擾細(xì)胞的吞噬活動(dòng)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡與死亡，其機(jī)理與氯離子通道介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酸化調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究為氟斑牙的生物學(xué)產(chǎn)生機(jī)理增加了新的研究內(nèi)容，從氯離子通道的角度重新審視了氟離子影響成釉細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制