新型骨修復(fù)材料的制備與體外研究.pdf

1、目的:
　　本研究以PGA和β-TCP為基料制備復(fù)合支架材料，并觀察復(fù)合支架材料的微觀結(jié)構(gòu)，測(cè)試其孔隙率、抗壓強(qiáng)度。將富血小板血漿(Platelet-Rich-Plasma，簡(jiǎn)稱PRP)作為內(nèi)源性生長(zhǎng)因子與制備出的復(fù)合支架材料復(fù)合研究其對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化作用。為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.改良溶液澆鑄-離子瀝濾法制備質(zhì)量比1:1(A組)與1:3(B組)的PGA/β-TCP復(fù)合支架材料，掃描

2、電鏡(SEM)觀察兩組支架材料的微結(jié)構(gòu)，用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)制備的試樣進(jìn)行抗壓縮強(qiáng)度的測(cè)試，用液體置換法測(cè)試PGA/β-TCP復(fù)合支架材料的孔隙率。
　　2.成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無(wú)菌條件下處死一日齡SD大鼠，超凈臺(tái)下剝離出顱骨片，Ⅰ型膠原酶消化成單個(gè)細(xì)胞后以10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、純化。傳至第三代，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，堿性磷酸酶染色法、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法鑒定成骨細(xì)胞。
　　3.取SD大鼠全血，兩步離心法制備P

3、RP，將上步培養(yǎng)的三代成骨細(xì)胞接種于制備好的PGA/β-TCP復(fù)合支架材料上并與PRP復(fù)合。實(shí)驗(yàn)A組為成骨細(xì)胞復(fù)合5％PRP/PGA/β-TCP支架，B組為成骨細(xì)胞復(fù)合10％PRP/PGA/β-TCP支架。對(duì)照組為成骨細(xì)胞復(fù)合不加PRP的PGA/β-TCP材料。于培養(yǎng)的1d、2d、3d時(shí)做細(xì)胞增殖MTT檢測(cè)，2d、4d、6d做堿性磷酸酶定量檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.SEM照片可見(jiàn)兩組支架材料均為三維多孔結(jié)構(gòu)，孔隙的連通性好

4、。β-TCP均勻地分散于聚合物中，B組支架材料中β-TCP顆粒明顯多于A組。B組支架材料的抗壓縮強(qiáng)度大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；A、B組支架材料孔隙率均大于85％，A組孔隙率大于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.倒置顯微鏡下可見(jiàn)48h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞體積較大，呈三角形、多角形或不規(guī)則形。胞漿豐富并向外伸展，有突起。7d后細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞間出現(xiàn)融合，細(xì)胞邊界不清。第三代細(xì)胞堿性磷酸酶染色可

5、見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞核、胞質(zhì)內(nèi)染色呈陽(yáng)性。鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色可見(jiàn)細(xì)胞之間有團(tuán)塊狀的鈣鹽沉積，呈橘紅色或深紅色。礦化結(jié)節(jié)大小不一，有的多個(gè)礦化結(jié)節(jié)可以融合。
　　3.實(shí)驗(yàn)A、B組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，實(shí)驗(yàn)A、B組較對(duì)照組各相同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖明顯上升，同一時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)B組測(cè)得的OD值最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組在2d時(shí)檢測(cè)出堿性磷酸酶的活性均較低，
　　4、6d時(shí)三組成骨細(xì)胞ALP的活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨

6、勢(shì)，實(shí)驗(yàn)B組成骨細(xì)胞ALP的活性隨時(shí)間變化最為明顯，其6d時(shí)成骨細(xì)胞ALP含量顯著高于2d時(shí)的ALP含量。對(duì)照組各相同時(shí)點(diǎn)ALP的活性雖也有升高，但都低于實(shí)驗(yàn)兩組。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.A、B組PGA/β-TCP復(fù)合支架材料孔隙率均在85％以上，B組復(fù)合支架抗壓縮強(qiáng)度顯著高于A組，B組(1:3質(zhì)量比)PGA/β-TCP復(fù)合支架更能適應(yīng)臨床對(duì)支架材料的要求。
　　2.PRP可以促進(jìn)PGA