TiO2納米管抗菌與生物活性雙功能種植體涂層的構(gòu)建與評價.pdf

1、【背景】
　　牙科種植技術(shù)已成為牙列缺損或缺失的重要修復(fù)方法之一，但牙種植體相關(guān)感染仍是嚴(yán)重威脅，帶來一系列并發(fā)癥。種植體相關(guān)感染高發(fā)的原因主要有兩點：一是菌斑容易在種植體表面聚集且一旦形成很難去除；二是由于種植體的生物活性尚不理想，在種植體骨結(jié)合界面存在乏血管的纖維層使局部宿主抵抗力低下。因此，針對這兩點在種植體表面制備同時具有抗菌和高生物活性雙功能的涂層對于預(yù)防種植體相關(guān)感染，延長其使用壽命具重要意義。
　　人體自然組織

2、是由納米模塊組裝起來的，因此從仿生學(xué)的角度來看納米結(jié)構(gòu)應(yīng)該具有更好的生物活性。二氧化鈦（TiO2）納米管（NT）制備工藝簡單而且它用電化學(xué)處理制備，適合應(yīng)用于形狀復(fù)雜的種植體表面。TiO2-NT的管徑可在幾十到幾百納米范圍內(nèi)變化，有利于篩選適合不同組織結(jié)合的納米尺寸。此外，TiO2-NT結(jié)構(gòu)能夠模擬骨組織中膠原原纖維的尺寸和排列，并且具有和骨組織相近的彈性模量。因此，通過優(yōu)化TiO2-NT結(jié)構(gòu)有希望獲得理想的生物活性。
　　阻止種

3、植體表面生物膜形成最有效的辦法是預(yù)防細(xì)菌的早期粘附，因為生物膜一旦形成很難去除。從這個角度出發(fā)，抗菌涂層特別是載抗菌劑的涂層是一個有效途徑。TiO2-NT很好的一個優(yōu)點是它可作為藥物的載體，因此通過載入合適的抗菌劑可獲得抗菌能力。多種不同的抗生素都被嘗試用于抗菌涂層的制備，但抗生素的使用所帶來的產(chǎn)生耐藥菌株的風(fēng)險嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用。經(jīng)過文獻(xiàn)回顧我們認(rèn)為銀是制備抗菌涂層的較為理想的選擇。銀具有多方面的優(yōu)點如廣譜抗菌能力甚至包括某些抗生素

4、耐藥菌、在合適的濃度時很好的生物相容性、良好的穩(wěn)定性以及產(chǎn)生耐藥菌的風(fēng)險小等。此外，由于銀抗菌的有效濃度很低，可以通過在TiO2-NT中載入足夠多的銀和控制釋放速度獲得長期抗菌能力。
　　【目的】
　　探明影響TiO2-NT生物活性的因素，基于TiO2-NT篩選和研發(fā)具有更好生物活性的結(jié)構(gòu)；探索納米結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的機制，為進(jìn)一步指導(dǎo)種植體表面設(shè)計提供理論基礎(chǔ)；摸索合適的方法將銀載入TiO2-NT中以獲得長期抗菌能力；鑒于干

5、細(xì)胞在骨結(jié)合中的更重要的作用，研究TiO2-NT與干細(xì)胞的相互作用，為更合理的種植體表面設(shè)計提供依據(jù)；體內(nèi)試驗驗證這些結(jié)構(gòu)的效果。
　　【方法】
　　1）用陽極氧化方法在0.5wt％氫氟酸（HF）溶液中制備TiO2-NT，場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）觀察制備的TiO2-NT的管徑大小、管的完整性和膜的均勻程度等。觀察陽極氧化電壓和時間對形成的TiO2-NT的影響；2）采用大鼠原代成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法評價5VTiO2-NT

6、（5VNT）和20VNT的生物活性。檢測不同電壓所形成的TiO2-NT的表面能差異，用DAPI染細(xì)胞核然后計數(shù)細(xì)胞粘附，MTT法測細(xì)胞活性，免疫熒光染色和SEM觀察細(xì)胞形態(tài)，試劑盒檢測細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性，實時定量PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)；3）評價5VNT和20VNT經(jīng)高溫高壓、紫外照射和酒精浸泡消毒后生物活性的差異。測量不同方法消毒后試樣表面能的差異，試劑盒檢測其蛋白吸附能力以及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性，用前面述及的方法檢測

7、細(xì)胞粘附、活性、胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，天狼星紅染色法檢測細(xì)胞膠原分泌，茜素紅染色法檢測細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）礦化；4）采用酸蝕加陽極氧化處理的方法制備微米坑/納米管梯度形貌，并用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)的方法評價該仿生梯度形貌的生物活性；5）以成分為碳化鈦/碳?xì)ず私Y(jié)構(gòu)（TiC/C）或表面成分為TiO2的準(zhǔn)平行豎直排列的納米線陣列(QANWAs)為模型，用體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)的方法探索納米結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的機制；6）硝酸銀浸

8、泡加光照還原的方法將銀納米顆粒載入TiO2-NT中，控制硝酸銀的濃度和浸泡時間載入不同量的銀，體外評價其長期抗菌能力和生物相容性；7）體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），觀察TiO2-NT以及微米/納米梯度結(jié)構(gòu)在無成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（OS）的情況下對MSCs成骨分化的影響。CCK-8檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，觀察細(xì)胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量、膠原分泌和ECM礦化和基因表達(dá)水平。阻斷ERK1/2、JNK和PI3K/Akt信號

9、通路后觀察膠原分泌和ECM礦化；8）觀察OS對鈦和細(xì)胞培養(yǎng)板（TCP）表面培養(yǎng)的MSCs成骨分化的影響；9）體內(nèi)試驗驗證試樣的體內(nèi)效果。
　　【結(jié)果】
　　1）成功制備均勻分布的TiO2-NT結(jié)構(gòu)，管徑與陽極氧化電壓正相關(guān)，在3-20V的電壓下進(jìn)行陽極氧化分別形成管徑20-100nm的TiO2-NT陣列；2）在TiO2-NT表面早期細(xì)胞粘附未受明顯影響，與拋光鈦相比TiO2-NT提高成骨細(xì)胞ALP活性并誘導(dǎo)更多的ECM沉積。

10、細(xì)胞緊密地粘附到拋光鈦表面并且互相接觸，幾乎完全覆蓋整個表面，在5VNT表面細(xì)胞伸出結(jié)實的板狀偽足，而在20VNT表面細(xì)胞伸出大量纖細(xì)的絲狀偽足。細(xì)胞生長略受抑制，但細(xì)胞成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)受到明顯抑制特別是在20VNT表面；3）與高溫高壓消毒相比，紫外照射和酒精浸泡消毒試樣的表面自由能較高，細(xì)胞粘附和增殖較好。其中紫外照射消毒表面的細(xì)胞功能最好，包括細(xì)胞粘附、增殖以及以ECM沉積及礦化和成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)為標(biāo)志的細(xì)胞分化。不同消

11、毒方法的使用影響對納米形貌和拋光對照之間的生物活性的對比。如高溫高壓消毒后TiO2-NT表面的細(xì)胞早期粘附數(shù)量較多，但當(dāng)用紫外照射或酒精浸泡消毒時這一差異消失。當(dāng)采用酒精浸泡消毒時20VNT表面的細(xì)胞增殖比其它兩個試樣好，但當(dāng)采用紫外照射或高溫高壓消毒時三個試樣表面的細(xì)胞增殖無差異；4）成功制備微米坑/納米管梯度仿生形貌。發(fā)現(xiàn)酸蝕微米形貌對成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用不均衡，雖然細(xì)胞早期粘附和成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)得到促進(jìn)，但細(xì)胞其它功能被抑

12、制。在微米形貌上加入納米管之后同時促進(jìn)或保持成骨細(xì)胞的多個功能；5）成功制備TiC/C和TiO2兩種不同表面成分的QANWAs，TiC/CQANWAs為超疏水性而TiO2QANWAs與光滑對照相比更加親水。QANWAs阻礙細(xì)胞粘附導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其它的細(xì)胞功能如增殖和分化也明顯受到抑制。QANWAs的細(xì)胞排斥特性主要來源于它們的特殊結(jié)構(gòu)，不受表面化學(xué)成分和表面潤濕性的影響，也并非源于蛋白吸附量的降低；6）通過硝酸銀浸泡加光照還原的方法成功

13、制備載銀納米管（NT-Ag），銀納米粒子緊密地粘附到納米管的內(nèi)壁，并且銀納米粒子的大小可以通過控制硝酸銀的濃度和浸泡時間來調(diào)整。NT-Ag在第一周內(nèi)可有效殺滅種植體周圍浮游細(xì)菌，而其預(yù)防活細(xì)菌粘附的能力在觀察的兩周內(nèi)無明顯下降；7）首次系統(tǒng)地觀察了TiO2-NT、酸蝕形貌、微米/納米梯度形貌在不使用OS的條件下對MSCs成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)所有的這些形貌均可在無OS的情況下誘導(dǎo)MSCs成骨分化。其中，20VNT和Micro/20VNT誘

14、導(dǎo)MSCs成骨分化的能力最強；8）在TCP表面OS的使用略微抑制MSCs增殖但明顯促進(jìn)以膠原分泌和ECM礦化為代表的MSCs分化。而在鈦表面，OS仍就抑制MSCs增殖且該作用與TCP表面相比稍微明顯一些，但細(xì)胞分化并未像在TCP表面那樣受到促進(jìn)而是遭到顯著抑制，細(xì)胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量、膠原分泌和ECM礦化均降低。OS在鈦表面對干細(xì)胞分化的抑制作用與其表面形貌無關(guān)；9）體內(nèi)預(yù)實驗結(jié)果表明20VNT在早期可促進(jìn)種植體骨結(jié)合。
　

15、　【結(jié)論】
　　1）可以通過簡單的陽極氧化方法在鈦表面制備不同管徑（20-100nm）的TiO2-NT，從而可以篩選適合不同組織結(jié)合的納米尺寸。
　　2）TiO2-NT尤其是較大管徑的納米管抑制原代成骨細(xì)胞的某些功能如成骨相關(guān)功能基因的表達(dá)，原因在于TiO2-NT阻礙其表面細(xì)胞粘著斑的組裝。原代成骨細(xì)胞與細(xì)胞系表型的不一致使它們對TiO2-NT的反應(yīng)不同，可能是目前關(guān)于TiO2-NT生物活性存在爭議的原因。
　　3）消

16、毒方法明顯影響TiO2-NT的表面特性從而影響其表面成骨細(xì)胞功能。各試驗中使用的不同消毒方法影響對納米形貌和拋光對照之間的生物活性的對比，提示消毒方法的不一致是目前關(guān)于TiO2-NT生物活性的報道出現(xiàn)爭議的一個重要原因。其中紫外照射消毒表面的細(xì)胞功能最好，原因在于紫外照射消毒能有效去除試樣表面的碳?xì)湮廴尽?br>　　4）酸蝕微米形貌對成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用不均衡，在微米形貌上加入納米管之后更平衡地促進(jìn)或保持成骨細(xì)胞的多個功能。該結(jié)果首次

17、揭示了微米和納米形貌對細(xì)胞功能的協(xié)同作用，提示微米/納米梯度結(jié)構(gòu)可能從生物學(xué)的角度來講更合理，這對種植體表面設(shè)計具有很大指導(dǎo)意義。
　　5）QANWAs阻礙細(xì)胞粘附導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，原因可能在于對細(xì)胞粘著斑組裝的阻礙。該結(jié)果提示納米形貌包括TiO2-NT調(diào)控細(xì)胞功能的一個重要機制就是調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，包括整合素的簇集和粘著斑的組裝和成熟。
　　6）通過簡單的硝酸銀浸泡加光照還原的方法可以制備NT-Ag。載有適量銀的NT-Ag在早期一

18、周內(nèi)可有效殺滅種植體周圍浮游細(xì)菌，而其預(yù)防活細(xì)菌粘附的能力在觀察的兩周內(nèi)無明顯下降，提示NT-Ag的長效抗菌能力。雖然NT-Ag表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，但在接下來的試驗中我們可以通過縮小管口等方法控制銀的釋放速率以消除細(xì)胞毒性。
　　7）20VNT和微米/20VNT梯度形貌誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的能力最強。形貌因素的骨誘導(dǎo)能力源于它們對細(xì)胞粘著斑以及接下來的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。ERK1/2、JNK和PI3K/Akt均參加了微米/納米形貌表面