下調(diào)Ape1-Ref-1在Genistein防護(hù)放射性肺損傷和PDT對非小細(xì)胞肺癌殺傷作用的實驗研究.pdf

1、放射性肺損傷(Radiation-inducedlunginjury,RILI)是戰(zhàn)時或平時如核武器損傷、核輻射事故、造血干細(xì)胞移植預(yù)處理以及胸部腫瘤放療的常見嚴(yán)重并發(fā)癥,且目前的臨床救治措施并不能有效預(yù)防或轉(zhuǎn)歸放射性肺炎及進(jìn)一步的纖維化,病死率極高。制約放射性肺損傷治療的關(guān)鍵問題一個是DNA氧化損傷,一個是含氧中間產(chǎn)物活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)驅(qū)動氧化應(yīng)激、啟動肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞產(chǎn)

2、生的炎性細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)。對于DNA氧化損傷,電離輻射的生物學(xué)研究表明,細(xì)胞DNA是電離輻射(IR)最為主要的靶分子,IR可通過直接電離和ROS間接作用致細(xì)胞嘌呤和嘧啶堿基氧化、堿基缺失(AP位點)以及單鏈斷裂進(jìn)而形成雙鏈斷裂,人體細(xì)胞乃至所有生物細(xì)胞都存在著核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)和錯配修復(fù)等四個較為完善的DNA修復(fù)通路,這是細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定和完整的一種基本防御及保護(hù)機(jī)制。目前的研究表明,脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(a

3、purinic/apyrimidinicendonuclease1,APE1)又稱為氧化還原因子(redoxfactor-1,Ref-1),它不僅是DNA堿基切除修復(fù)途徑的主要限速酶,還是一種能通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子氧化還原狀態(tài),對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有防御作用的保護(hù)基因。已有研究提示輻射誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)可能在調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生非靶向性效應(yīng),從而在介導(dǎo)和放大放射性肺損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用,針對抑制NF-κB活性

4、的研究將可能為開發(fā)放射性肺損傷特殊的治療方法提供一個平臺。多酚類小分子化合物三羥基異黃酮具有下調(diào)輻射所致Ape1/Ref-1表達(dá)增加從而抑制NF-κBDNA結(jié)合活性功能。但目前關(guān)于Ape1/Ref-1蛋白在放射性肺損傷的表達(dá)特點、規(guī)律及作用機(jī)制尚不清楚,也無明確有效的RILI防治措施,嚴(yán)重制約著放射性肺損傷的防治,研究闡明這些問題對提高放射性肺損傷的救治水平有非常重要的意義。
　　研究目的:
　　1.研究三羥異黃酮(geni

5、stein,GEN)下調(diào)Ape1/Ref-1的表達(dá)對放射性肺損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制,為防治放射性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　2.研究Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合血卟啉衍生物(hematoporphrphyrinderivative,HpD)介導(dǎo)的光動力療法(photodynamictherapy,PDT)對人肺腺癌細(xì)胞A549的殺傷作用及其分子機(jī)制,進(jìn)一步驗證在放射性肺損傷防護(hù)中Ape1/Ref-1-NF-κ

6、B的作用途徑,理論上進(jìn)一步豐富我們對Ape1/Ref-1分子生物功能的認(rèn)識。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒的構(gòu)建、擴(kuò)增;
　　2.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷的效應(yīng)觀察:建立三羥異黃酮及氨磷汀防護(hù)放射性肺損傷小鼠模型(與對照組比較):不同時間給予三羥異黃酮及氨磷汀,檢測組織病理形態(tài)、肺組織羥脯氨酸含量;應(yīng)用液相芯片法、雙抗體夾心法、ROS特異性熒光探針技術(shù)檢測血清、肺泡灌洗液

7、中炎性細(xì)胞因子(IL-1、TNF-α、IL-6、TGFβ1)/炎性細(xì)胞數(shù)和胞內(nèi)ROS含量的改變;以明確三羥異黃酮的防護(hù)效應(yīng)、給藥時機(jī)、量效和時效關(guān)系,為下一步實驗做準(zhǔn)備;
　　3.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷靶細(xì)胞(肺泡II型上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的機(jī)制探討:應(yīng)用對照研究,采用Westernblot法及EMSA等技術(shù)檢測三羥異黃酮下調(diào)輻射所致Ape1/Ref-1表達(dá)增加;三羥基異黃酮下調(diào)Ape1/Ref-1表達(dá)對NF-κB活性的影響;

8、
　　4.調(diào)控Ape1/Ref-1對協(xié)同效應(yīng)的影響及可能機(jī)制:應(yīng)用外源性干預(yù)(Ape1/Ref-1RNAi轉(zhuǎn)染)對A549細(xì)胞增殖抑制影響;Westernblot法及EMSA法分別檢測APE1蛋白的表達(dá)及NF-κB活性影響來驗證下調(diào)Ape1/Ref-1與NF-κB的協(xié)同效應(yīng)及可能機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷的效應(yīng)觀察:病理檢測顯示照射后時間越長,放射性肺損傷小鼠肺纖維化越重,三羥異黃酮能減

9、輕肺組織炎癥及纖維化;照射后小鼠血清及肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-6、IL-1和TNF-α等炎性因子和肺組織羥脯氨酸的含量也呈遞增趨勢,三羥異黃酮能降低各種炎性因子和羥脯氨酸的含量(P<0.05),尤其是照射前24h給予三羥異黃酮能達(dá)到與照射前30分鐘給予氨磷汀類似的療效。
　　2.三羥異黃酮防護(hù)放射性肺損傷的機(jī)制探討:經(jīng)射線照射后,A549細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高,三羥異黃酮能明顯降低胞內(nèi)ROS的表達(dá);三羥異黃酮能下調(diào)放療所

10、致的APE1蛋白及NF-ΚB表達(dá)的升高(P<0.05)。
　　3.驗證調(diào)控Ape1/Ref-1對NF-κB協(xié)同效應(yīng)的影響:HpD-PDT作用后,A549細(xì)胞增殖受抑、凋亡增加顯著高于對照組(P<0.05),其抑制效率依賴于HPD濃度及激光劑量,同時Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合PDT對A549細(xì)胞具有更明顯的增殖抑制作用,胞內(nèi)ROS含量及炎性因子的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。HpD-PDT誘導(dǎo)A549細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)

11、增強(qiáng)在24h達(dá)到高峰,10MOIAd5/F35-APE1siRNA重組腺病毒感染A549細(xì)胞48小時抑制APE1表達(dá)最為顯著。
　　結(jié)論:
　　1.放射性肺損傷小鼠模型研究顯示,輻射誘導(dǎo)肺組織核蛋白APE1/Ref-1表達(dá)顯著增高,呈現(xiàn)由胞核向胞漿移位并先增高后降低特征;輻射誘導(dǎo)APE1/Ref-1表達(dá)增加和異位表達(dá),可通過其DNA損傷修復(fù)和/或氧化還原功能影響放射性肺損傷修復(fù)。
　　2.APE1/Ref-1是炎性因子

12、的調(diào)控因子,血清/肺泡灌洗液TGF-β1、IL-6、IL-1β和TNF-α含量是放射性肺損傷的預(yù)測指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)為預(yù)測放射性肺損傷的發(fā)生提供了生物學(xué)預(yù)測指標(biāo)。
　　3.三羥異黃酮調(diào)控APE1/Ref-1表達(dá)防護(hù)放射性肺損傷的重要作用并闡明了其調(diào)控機(jī)制。三羥異黃酮可顯著減輕放射性肺損傷小鼠肺泡腔內(nèi)炎性滲出以及肺組織羥脯氨酸含量和膠原纖維沉積,其作用機(jī)制與其降低APE1/Ref-1及NF-ΚB表達(dá)從而減輕炎性因子分泌有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)為放

13、射性肺損傷的防治提供了新的手段和方法。
　　4.三羥異黃酮對防護(hù)放射性肺損傷具有獨特優(yōu)勢。對于肺部腫瘤放射治療,三羥異黃酮在下調(diào)Ape1/Ref-1表達(dá)防護(hù)RILI的同時,尚可通過調(diào)控其DNA損傷修復(fù)和Redox雙功能增加肺癌細(xì)胞放射治療敏感性。
　　5.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒能顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞PDT敏感性,主要是通過2種機(jī)制實現(xiàn)的:一方面通過抑制A549細(xì)胞PDT后的DNA損傷修復(fù)能力;另一方面通