重組全長(zhǎng)人釉原蛋白制備及其細(xì)胞生物學(xué)作用評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:牙周組織再生是臨床牙周治療的終極目標(biāo),盡管釉基質(zhì)蛋白(Enamelmatrix proteins,EMPs)能夠誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)牙周組織的功能性重建,但現(xiàn)有商品化的豬EMPs存在著來源限制及其他成分干擾等諸多問題。近年來有研究提出EMPs的主要成分釉原蛋白(amelogenin,Am)是其誘導(dǎo)牙周組織再生的關(guān)鍵,有望替代EMPs用于牙周組織再生。然而,對(duì)單一成分Am的細(xì)胞生物學(xué)活性及其與EMPs的比較目前還缺乏系統(tǒng)研究,而Am本身異質(zhì)性和

2、表達(dá)的時(shí)空特異性使其單一組分的提取純化極為困難,因此,本課題擬分別純化原核大腸桿菌和真核畢赤酵母表達(dá)的重組全長(zhǎng)人釉原蛋白(rhAm175),比較不同來源的rhAm175與天然EMPs對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞(Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)生物學(xué)作用的差異。初步探討rhAm175促進(jìn)牙周組織再生的作用和可能機(jī)制,為rhAm175代替EMPs用于牙周組織再生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將全長(zhǎng)人

3、Am編碼序列分別插入選擇原核表達(dá)載體pET28a或真核表達(dá)載體pPIC3.5K中,重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)和P.pastoris GS115(Mut+)感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽性克隆。誘導(dǎo)表達(dá)的重組全長(zhǎng)人釉原蛋白(E-rhAm175和Y-rhAm175)通過鎳柱親和層析純化,并經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡法(WB)鑒定。乙酸法提純豬釉基質(zhì)蛋白(pEMPs)。比較E-rhAm175、Y-rhAm17

4、5和pEMPs對(duì)體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化的影響,并分析可能參與這些細(xì)胞生物學(xué)作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子——細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal response kinase,ERK1/2)和Akt激酶(Akt kinases/protein kinase B,Akt/PKB)的活化情況。
　　結(jié)果:1、分別在E.coli BL21(DE3)和P.Pastoris GS115(Mut+)細(xì)

5、胞中成功表達(dá)E-rhAm175和Y-rhAm175,通過親和層析法獲得純化的重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和WB鑒定為全長(zhǎng)人釉原蛋白。2、10 ug/ml和20ug/ml的E-rhAm175或Y-rhAm175均能顯著促進(jìn)hPDLFs黏附、遷移和增殖,抑制成骨分化標(biāo)志物(ALP、OCN、COL I、Runx2)的mRNA表達(dá)水平,其作用與200ug/ml pEMPs之間無明顯差異。3、E.rhAm175、Y-rhAm175或pEMPs均通