熱休克蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表達及機理研究.pdf

1、淋巴瘤是血液科常見疾病，占每年新發(fā)腫瘤病例的5％，腫瘤死亡病例的3％。近30年來其發(fā)病率增高了2倍，導致這種情況的原因尚不明確。在所有的惡性淋巴瘤中非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）約占80％。多數(shù)NHL治療效果較霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）差。聯(lián)合化療及美羅華等靶向治療雖然可以使NHL生存期明顯延長，但仍有部分患者復發(fā)、耐藥并最終死亡。因此迫切需要對NHL發(fā)病機理進行更

2、深入研究，以期發(fā)現(xiàn)更有效的治療手段和措施。 熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）廣泛存在于多種細胞內(nèi)，在熱刺激、缺氧、創(chuàng)傷、氧化應激、藥物等各種應激誘導下表達增加。通過參與細胞內(nèi)蛋白質的折疊、伸展、轉運和跨膜等過程HSPs發(fā)揮其“分子伴侶”功能，使細胞應對應激的能力增強。HSPs還具有抗凋亡的作用，它可以抑制凋亡通路中的多種蛋白，從而在凋亡通路的不同階段阻斷凋亡的發(fā)生。此外HSPs與腫瘤免疫也有密切的相

3、關，研究表明HSPs能加強腫瘤的免疫原性，參與呈遞腫瘤抗原，激發(fā)腫瘤免疫反應。 由于在多種腫瘤細胞及組織中有高水平表達，并且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、生物學行為及預后有密切的關系，HSPs可以作為判斷病情和預測預后的指標。部分研究還將HSPs作為腫瘤治療的靶點。在體外實驗中應用反義寡核苷酸或siRNA特異性抑制HSPs的表達，可以誘導腫瘤細胞凋亡和增強化療敏感性。HSP90的抑制劑17-AAG在一期臨床實驗中顯示了良好的療效，目前已經(jīng)進

4、入二期臨床實驗。上述以HSPs為靶點的治療為我們更好的治療惡性疾病提供了新思路。 在多數(shù)腫瘤中HSPs高表達是分期晚、治療效果不佳和預后差的標志，但是HSPs在NHL中的相關表達通路及與疾病的生物學行為之間的關系目前仍不明確。本研究應用分子生物學技術探討HSPs與淋巴瘤臨床表現(xiàn)、惡性程度及治療效果之間的相關性，并通過體外實驗分析NHL Raji細胞中HSP70作用的相關通路和機理，希望對淋巴瘤的生物學特征有更深入的了解，為疾病的

5、診斷和治療服務。 論文一 PI3K/AKT通路在熱處理誘導Raji細胞表達HSP70中的作用 目的：熱療和化學治療以及放射治療聯(lián)合可以用來治療多種腫瘤。但是熱療的應用價值受到許多因素的影響，其中之一就是熱休克反應。熱休克反應是細胞內(nèi)高度保守的分子應激反應，在這一過程中熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）表達增加。而HSPs可以保護細胞免于一系列化學、物理和生物應激原的損傷。熱休克蛋白70（Hea

6、t Shock Protein70，HSP70）是熱休克蛋白家族最主要的成員之一。研究表明HSP70對凋亡有抑制作用，HSP70表達增加可以減少化療藥物及射線誘導的腫瘤細胞凋亡。因此熱處理誘導的HSP70表達增高，可能會對抗腫瘤治療產(chǎn)生不良影響。HSP70的表達主要受熱休克因子1（Heat shock factor1，HSF1）的調控。最新研究顯示PI3K可以影響HSF1的活性，進而影響HSP70的表達。抑制PI3K/AKT通路后，細胞

7、內(nèi)HSP70表達降低。因此PI3K/AKT通路可能成為一個新的抑制HSP70表達的靶點。本研究利用LY294002（一種PI3K抑制劑）抑制PI3K/AKT通路，以探討該通路在熱處理誘導Raji細胞表達HSP70過程中的作用，并檢測熱處理誘導的HSP70表達對Raji細胞凋亡和化療敏感性的影響。 方法：根據(jù)細胞處理的不同方式，實驗分為3組： 1）對照組：Raji細胞不經(jīng)過熱處理，直接加用化療藥物作用； 2）熱處理

8、組：Raji細胞首先經(jīng)42℃熱處理，隨后在37℃培養(yǎng)4h，然后加入化療藥物作用； 3）LY294002預處理后加熱處理組：細胞首先經(jīng)LY294002預處理，隨后按照2組的方法處理。 用Western blotting分析不同處理后HSP70，AKT和P-AKT的表達。用AnnexinⅤ-PI雙染來檢測細胞凋亡率的變化。用WST-8法檢測ADM和DDP對Raji細胞的毒性。 結果： 1.PI3K抑制劑抑制熱

9、處理誘導的HSP70表達 42℃熱處理后2小時即有HSP70的表達增加。熱處理后8小時，Raji細胞內(nèi)HSP70表達達到最高峰。在加熱處理后24小時，HSP70表達仍然高于對照組。熱處理后4小時HSP70表達明顯增加，同時伴有AKT活化（P<0.05）。而如果在熱處理前用LY294002預處理細胞，則HSP70表達及AKT活化明顯減弱（P<0.05）。 2.熱處理使Raji細胞抵抗DDP誘導的細胞凋亡 42℃熱處

10、理后24小時，Raji細胞凋亡率從6.44±0.64％上升到6.95±0.57％，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。用5ug/ml和10ug/ml DDP單獨處理Raji細胞24小時，分別誘導了14.1％±0.5％和16.9％±1.14％的凋亡率。而如果在熱處理后應用DDP，則凋亡率下降到9.73％±0.28％和10.50％±0.85％（P<0.01）。 3.PI3K抑制劑可以抵消熱處理對Raji細胞的保護作用 熱處理前

11、分別應用10umol和20umol的LY294002來抑制HSP70的表達，觀察細胞凋亡率的改變。與未用LY294002相比，應用LY294002后5ug/ml DDP誘導的凋亡率有了明顯的升高。10umol和20umolLY294002分別將凋亡率從9.73％±0.28％提高到15.33％±0.45％和19.5％±0.75％，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 4.PI3K抑制劑增強了熱處理后Raji細胞對ADM和DDP的敏感

12、性 在經(jīng)42℃加熱預處理后，Raji細胞對ADM的敏感性明顯下降，IC50從5.2ug/ml上升到17.0ug/ml。而如果在熱處理前應用LY294002處理細胞，則可以顯著增強ADM的敏感性，并且呈計量依賴性。10umol、20umol和40umolLY294002分別使ADM的IC50下降至10.6 ug/ml、8.8ug/ml和3.6ug/ml。應用DDP進行實驗，趨勢與上述結果一致。 結論： 1.本研究首

13、次證實在熱誘導的Raji細胞內(nèi)存在PI3K/AKT/HSP70表達通路。PI3K抑制劑LY294002可以抑制熱處理誘導的HSP70表達。本研究為抑制Raji細胞中熱誘導的HSP70表達提供了新思路。 2.適當溫度的熱處理對Raji細胞有保護作用。當熱處理誘導的HSP70表達被抑制后，該保護作用減弱甚至消失。因此熱處理對Raji細胞的保護作用可能是通過誘導HSP70表達來實現(xiàn)的。 論文二熱休克蛋白70、90α在非霍奇金淋

14、巴瘤中的表達及臨床意義 目的：HSP70和HSP90是熱休克蛋白家族中兩個最重要同時也是研究最深入的成員。多種腫瘤組織中有HSP70和HSP90的表達，并且與腫瘤的分期和預后相關。但是在不同腫瘤中HSP70和HSP90所體現(xiàn)的意義不盡相同，部分研究的結果甚至是相互矛盾的。這可能與腫瘤的特異性有關。有研究表明在淋巴瘤細胞中有HSP70和HSP90表達，但未能明確兩者表達與淋巴瘤臨床表現(xiàn)和治療效果的關系。我們通過免疫組織化學技術檢測

15、兩種熱休克蛋白HSP70和HSP90α在NHL、壞死性淋巴結炎和淋巴結反應性增生組織中的表達并探討其意義。 方法：選取資料完整的NHL病例30例；年齡6～84歲，平均年齡43.6歲。所有標本均經(jīng)兩位病理學專家重新閱片證實。按Ann Arbor分期法對NHL進行分期。參照美國國立癌癥研究所工作分型（1982年）進行病理分型。10例壞死性淋巴結炎和12例淋巴結反應性增生組織作為對照。用免疫組化法檢測HSP70和HSP90α在三種組織

16、中的表達。HSP70及HSP90α均以細胞核或胞漿黃染為陽性。計算陽性細胞百分數(shù)：≤5％為（-），6～25％為（+），26～50％為（++），>50％為（+++）；（+++）為高表達。 結果：HSP70、90α均表達于NHL細胞胞漿和胞核。在NHL、壞死性淋巴結炎和淋巴結反應性增生組織中兩種熱休克蛋白均有高水平的表達，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。HSP70和HSP90α陽性表達與NHL惡性程度，分期，有無B癥狀，是否累計

17、結外及治療效果均無相關性（P>0.05）。HSP70高表達（陽性率大于50％）與NHL惡性程度，分期及治療效果密切相關（P<0.05），與是否有B癥狀、是否累及結外無關（P>0.05）。HSP90α高表達與上述指標無相關性（P>0.05）。 結論： 1.本研究首次應用免疫組化技術檢測了HSP70在NHL中表達情況，并證實在NHL組織中HSP70的高表達率與NHL惡性程度、分期及治療效果相關。因此HSP70可以作為判斷NH