野生型p53基因?qū)Π籽562細(xì)胞中心體的影響.pdf

1、最近大量的研究表明，實體瘤的發(fā)生和進展與中心體異常有關(guān)。中心體的異常導(dǎo)致異常有絲分裂、非整倍體的發(fā)生和基因組不穩(wěn)定。中心體異常包括中心體數(shù)量增多和中心體結(jié)構(gòu)異常。中心體數(shù)量增多與中心體過度復(fù)制、胞質(zhì)分裂失敗或中心體過早分離有關(guān)。中心體結(jié)構(gòu)異常與中心體蛋白過度表達(dá)或異常磷酸化狀態(tài)有關(guān)。進一步研究表明，實體瘤組織細(xì)胞中p53基因突變或缺失是導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生和基因組不穩(wěn)定的主要原因之一。P53蛋白的突變和缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期CDK激酶活性增高，

2、G1期和G2期檢查點失活，中心體在S期進行多次復(fù)制及在M期發(fā)生多極有絲分裂。近年來，由于異基因造血干細(xì)胞移植、干擾素及聯(lián)合化療的臨床應(yīng)用，慢性粒細(xì)胞白血病患者的生存期明顯延長，但仍有約70％的患者在發(fā)病后5年內(nèi)發(fā)生急變。急變期出現(xiàn)除費城染色體以外的遺傳學(xué)和染色體的改變，如染色體8和19的三倍體，而在分子水平出現(xiàn)p53基因的突變，其機理目前尚不清楚。最近對慢性粒細(xì)胞白血病各期患者的研究發(fā)現(xiàn)中心體異常，包括中心體數(shù)量增多和結(jié)構(gòu)異常。而且異常

3、的程度與臨床分期有關(guān)，急變期顯示更為嚴(yán)重的中心體異常。鑒于此，本研究擬選擇p53基因作為切入點，以p53基因突變的K562細(xì)胞為模型，觀察外源性野生型p53基因在K562細(xì)胞表達(dá)野生型P53蛋白后對中心體數(shù)量及中心體γ-微管蛋白表達(dá)的影響和對K562細(xì)胞增殖的影響，以期探索慢性粒細(xì)胞白血病急變發(fā)生機制以及用野生型p53基因治療白血病的可能性。 1．表達(dá)外源性野生型p53基因的白血病K562細(xì)胞模型的建立分別將含有野生型p53基因

4、、突變型p53基因和綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒表達(dá)載體(Ad5wtp53、Ad5mtp53和Ad5GFP)在293包裝細(xì)胞中反復(fù)擴增，病毒滴度測定后與陽離子polybrene共感染K562細(xì)胞，確定polybrene感染劑量。MTT 法確定最適重組腺病毒感染滴度和感染時間。最后應(yīng)用最適腺病毒感染滴度感染 K562 細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測p53mRNA和P53蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：三種重組腺病毒滴度分別

5、達(dá)到1.0×10<'10>efu/ml、1.0×10<'11>efu/ml、1.0×10<'11>efu/ml；polybrene的劑量選擇為4ug/ml；感染K562細(xì)胞的最適腺病毒滴度為20000MOI，感染時間為72小時；Ad5wtp53和Ad5mtp53感染K562細(xì)胞24小時后檢測到p53mRNA的表達(dá)，并可持續(xù)72小時。感染72小時后P53蛋白仍有表達(dá)。 2．重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因?qū)562細(xì)胞中心體數(shù)量和

6、蛋白的影響應(yīng)用間接免疫熒光染色法對中心體γ-微管蛋白和紡錘體α-微管蛋白同時進行標(biāo)記，用激光共聚焦顯微鏡觀察中心體γ-微管蛋白的表達(dá)和有絲分裂，并對中心體進行計數(shù)。與Ad5mtp53感染組和正常對照組相比，Ad5wtp53感染K562細(xì)胞72小時后，中心體γ-微管蛋白的表達(dá)降低，中心體數(shù)量減少。 3．重組腺病毒介導(dǎo)的野生型P53基因?qū)562細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析K562細(xì)胞周期、DNA含量的改變。Westernblo

7、t檢測P21蛋白、核磷蛋白(NPM)、磷酸化(Thr199)核磷蛋白(NPM)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：Ad5wtp53感染K562細(xì)胞48小時、72小時后細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，DNA 含量降低；同時P21蛋白的表達(dá)升高，核磷蛋白的表達(dá)無改變，磷酸化核磷蛋白(Thr199)表達(dá)下降。Ad5mtp53和 Ad5GFP 感染K562細(xì)胞48小時、72小時后細(xì)胞周期G0/G1期未見阻滯，DNA含量無明顯改變。同時P21蛋白的表達(dá)未見增高，核磷