菝葜治療慢性盆腔炎的活性部位篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、課題背景和目的：
　　 慢性盆腔炎疾病(CPID)系指女性內(nèi)生殖器官、周圍結(jié)締組織及盆腔腹膜發(fā)生慢性炎癥所致?？捎杉毙耘枨谎?PID)治療不徹底轉(zhuǎn)變而成，這是CPID發(fā)病的主要原因;亦可因體質(zhì)較強(qiáng)，或感邪較輕，受病后表現(xiàn)為癥狀較輕，病勢(shì)較緩的慢性盆腔炎[1]。據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心調(diào)查，美國每年150多萬婦女患PID，住院費(fèi)用達(dá)10.6億美元左右，并且每年有上百的PID患者死于并發(fā)癥。在美國青少年P(guān)ID感染率比成年婦女高，15

2、～24歲婦女是該疾病高發(fā)人群，以美國黑人和拉美裔女性較為常見[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，傳播疾病泛濫導(dǎo)致全世界每年新增3億3千多萬性病患者，其中有10％～20％將發(fā)展成為CPID[3]。在我國，由于個(gè)人衛(wèi)生條件及醫(yī)療條件的限制，或在婦科小手術(shù)和計(jì)劃生育手術(shù)中無菌操作不當(dāng)，加之廣泛應(yīng)用宮內(nèi)節(jié)育器時(shí)患者不注意個(gè)人衛(wèi)生等原因，使盆腔炎的發(fā)病率逐年提高。同時(shí)隨著性病在我國的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，由此引起的盆腔炎也在增多。
　　 由于抗生

3、素及手術(shù)治療CPID有許多弊端，中藥治療已日益成為治療CPID的研究熱點(diǎn)。大量文獻(xiàn)報(bào)道盆益康合劑[4]、黃芪注射液[5]等均能表現(xiàn)出既抗炎、又不易耐藥的良好特性，且具有用藥安全有效、副作用小、費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。金剛藤為菝葜的根部，為傳統(tǒng)活血化瘀中藥，市售金剛藤膠囊（菝葜提取物）已銷售十余年，用于治療CPID療效顯著，但其制劑較粗、藥效機(jī)理也未能得很好的闡明。因此，進(jìn)一步開發(fā)菝葜單味藥制備成有效部位，并探討其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用等與其治療作用

4、相關(guān)的機(jī)制具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值和實(shí)用臨床意義。
　　 本課題通過觀察小鼠耳腫脹、大鼠棉球肉芽腫及大鼠慢性盆腔炎疾病(CPID)模型中小鼠耳腫脹度、大鼠棉球肉芽腫抑制率、CPID動(dòng)物血液學(xué)指標(biāo)及病理改變，對(duì)菝葜醇提物及其3個(gè)化學(xué)部位，即:乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水溶液部位的抗炎及抗CPID活性作用進(jìn)行了比較和篩選，以確定其抗炎和抗CPID的活性部位，并通過柱分離對(duì)該部位做進(jìn)一步的分離純化，采用HPLC檢測(cè)其含量對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。在

5、獲得了藥效確切的活性部位后，亦通過觀察其對(duì)CPID模型大鼠血清、子宮組織中炎癥細(xì)胞因子、粘連相關(guān)指標(biāo)的影響，探討該活性部位對(duì)CPID的抗炎、抗粘連的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究力圖對(duì)菝葜的抗炎及抗CPID的有效物質(zhì)進(jìn)行富集，并闡明其藥理活性和作用機(jī)制，有助于獲得藥效物質(zhì)相對(duì)明確、藥理活性相對(duì)特異的菝葜活性部位，為進(jìn)一步開發(fā)菝葜抗CPID有效部位甚至單體化合物制劑提供科學(xué)依據(jù)。
　　 課題實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　 1、菝葜的提取分離

6、:采用正交設(shè)計(jì)L9(34)表，以乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間為考察因素，以HPLC色譜測(cè)定落新婦苷及黃杞苷的含量為考察指標(biāo)，對(duì)菝葜的提取方法進(jìn)行篩選，并確定菝葜最佳提取工藝。落新婦苷及黃杞苷的含量測(cè)定條件為:Hypersil ODS C18色譜柱;流動(dòng)相:乙腈:0.04％磷酸水;檢測(cè)波長(zhǎng)均為290nm;柱溫:室溫;流速:0.7ml·min-1。對(duì)正交試驗(yàn)所得各工藝樣品的落新婦苷和黃杞苷含量分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示:乙醇濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有

7、顯著性影響，其余各因素水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響均無顯著性差異(P＞0.05)。隨后采用綜合平衡法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，得到菝葜最佳提取工藝為:將菝葜飲片粉碎成小顆粒狀，加70％乙醇按乙醇∶水為1∶8、1∶5、1∶5提取3次，提取時(shí)間分別為2h、2h、1h。提取液過濾后，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，置于冰箱中冷藏12h，取出藥液，抽濾，合并濾液，加水定容即得，用于后續(xù)的研究。
　　 2、菝葜提取液3個(gè)化學(xué)部位的制備:采用液液萃取

8、方法進(jìn)行，以乙酸乙酯對(duì)提取液萃取得到乙酸乙酯部位，萃取后的藥液再以正丁醇萃取得到正丁醇部位，剩下的藥液為水溶液部位。乙酸乙酯和正丁醇萃取均采用水飽和的乙酸乙酯和水飽和的正丁醇，按體積比1∶1萃取至基本呈無色。采用25％苯酚膠漿0.06ml注入大鼠右側(cè)子宮制備大鼠CPID模型，觀察菝葜醇提物及3個(gè)化學(xué)部位高、中、低（相當(dāng)于臨床等效劑量的4、2、1倍）劑量組對(duì)CPID模型大鼠血液學(xué)及組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響，探討其對(duì)CPID的治療作用;采用

9、二甲苯致小鼠耳腫脹法，觀察菝葜醇提物及3個(gè)化學(xué)部位高、中、低（相當(dāng)于臨床等效劑量的4、2、1倍）劑量組對(duì)小鼠耳腫脹的抑制作用，探討其對(duì)急性炎癥的治療作用。其中二甲苯用量為每只小鼠右耳涂抹30μl，左耳做空白對(duì)照，20min后頸椎脫臼處死小鼠，以直徑8mm打孔器分別沿左右耳緣正中相同部位等面積打下兩圓形耳片，電子天平稱重，計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率;采用大鼠棉球肉芽腫法，觀察菝葜各化學(xué)部位高、中、低（相當(dāng)于臨床等效劑量的4、2、1倍）劑量組對(duì)

10、大鼠棉球肉芽腫的抑制作用，探討醇提物及3個(gè)化學(xué)部位抗慢性炎癥作用。其中高壓滅菌棉球（每個(gè)重50±1mg），臨用前用注射器注入頭孢美唑1 mg/0.1 ml，從切口向左側(cè)腹股溝植入皮下。結(jié)果顯示:菝葜醇提物組與乙酸乙酯部位的高、中劑量組能非常顯著地降低CPID模型大鼠增高的血液流變學(xué)指標(biāo)(P＜0.01)，對(duì)小鼠耳腫脹也有非常明顯地抑制作用(P＜0.01)，但低劑量效果均不顯著(P＞0.05);乙酸乙酯高劑量組對(duì)大鼠棉球肉芽腫也具有非常顯著

11、的抑制作用(P＜0.01)，菝葜醇提物高劑量組和乙酸乙酯部位中、低兩個(gè)劑量組對(duì)大鼠棉球肉芽腫具有顯著地抑制作用(P＜0.05)。其余各組，包括正丁醇組、水液組的抗炎及抗CPID效果均不明顯。鏡下觀察各組大鼠子宮組織的病理形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn):菝葜醇提物組和乙酸乙酯組能明顯減少慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善充血、水腫和宮壁各層結(jié)構(gòu)，大部分腺體結(jié)構(gòu)清晰完整，其中中劑量效果不如高劑量明顯，低劑量病理改變不明顯。正丁醇高劑量組炎癥改善不如乙酸乙酯組明顯，低

12、劑量組上皮細(xì)胞大量脫落至宮腔，炎性細(xì)胞覆蓋整個(gè)黏膜層，散見嗜酸性粒細(xì)胞。水液組與模型對(duì)照組比較鏡下觀察無明顯差異。上述結(jié)果顯示:菝葜的乙酸乙酯部位具有較好的抗急、慢性炎癥和CPID的作用，故選擇該部位進(jìn)行后續(xù)的研究。
　　 3、菝葜活性部位的分離純化:采用聚酰胺柱對(duì)菝葜乙酸乙酯部位進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，富集有效成分總黃酮。采用HPLC按“一標(biāo)多測(cè)”法，初步檢測(cè)其所含有效成分的含量，分析條件為:色譜柱:Hypersil ODS C1

13、8(4.6×250nm，5μm);流動(dòng)相:甲醇;流速:1ml·min-1;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):290nm;進(jìn)樣量:20μl。通過“面積歸一”法，以落新婦苷的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=5.561×105X-5.911×105，R2=0.9997。以峰面積累加，測(cè)得乙酸乙酯部位中的總黃酮的含量為55.73％。
　　 4、菝葜活性部位治療CPID的療效確證:菝葜按上述方法進(jìn)行提取、乙酸乙酯萃取

14、，再經(jīng)聚酰胺樹脂純化后得到了活性部位，其有效成分得到了富集、含量明顯提高，其活性強(qiáng)度有可能得到提高，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)我們降低了大鼠的給藥劑量，以臨床等效劑量作為中劑量，高、中、低劑量分別相當(dāng)于臨床等效劑量的2、1、1/2倍，較3個(gè)化學(xué)部位篩選時(shí)所用的劑量為低。于CPID造模后第7d開始，每日1次，連續(xù)給藥10d。于第11d，即末次給藥24h后，腹主動(dòng)脈采血，進(jìn)行血常規(guī)、血流變檢測(cè);肉眼觀察大鼠子宮造模側(cè)的形態(tài)變化;摘取子宮，稱重量，計(jì)算臟器

15、指數(shù);雙側(cè)子宮置10％甲醛固定液浸泡，HE常規(guī)染色，鏡下觀察大鼠子宮的病理改變。結(jié)果顯示:菝葜活性部位的高、中劑量均能顯著降低大鼠血液學(xué)指標(biāo)，包括全血粘度、血漿粘度和白細(xì)胞，有非常顯著性意義和顯著性意義(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，對(duì)大鼠子宮臟器指數(shù)的改善也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但低劑量效果不明顯。病理結(jié)果顯示純化后的菝葜活性部位低劑量與中藥陽性對(duì)照組能部分改善CPID模型大鼠子宮的炎癥程度，高、中劑量能在很大

16、程度上改善CPID模型大鼠子宮的病變程度，包括對(duì)炎癥損害的改善作用。上述結(jié)果表明:本研究制備得到的菝葜活性部位在臨床等效劑量情況下即具有顯著地抑制CPID的作用。
　　 5、菝葜活性部位治療CPID的作用機(jī)制研究:通過觀察菝葜活性部位對(duì)CPID模型大鼠血清、子宮組織中炎癥細(xì)胞因子、粘連相關(guān)指標(biāo)的變化，探討其治療CPID的抗炎抗粘連的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)以SD雌性大鼠為研究對(duì)象，將84只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組、

17、菝葜活性部位高、中、低劑量組、金剛藤膠囊組，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清的炎癥細(xì)胞因子水平，包括白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10);免疫組化法檢測(cè)各組大鼠子宮組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)大鼠子宮組織TNF-α mRNA及ICAM-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:菝葜活性部位能不同程度地調(diào)節(jié)模型大鼠血清中

18、IL-1β和IL-10的含量。其中對(duì)前炎癥細(xì)胞因子IL-1β的抑制作用，菝葜活性部位高、中、低3個(gè)劑量與模型對(duì)照組比較差異具有非常顯著性意義(P＜0.01);對(duì)抗炎癥細(xì)胞因子IL-10，菝葜活性部位高、中劑量組能顯著升高其在大鼠血清中的含量，差異具有非常顯著性意義(P＜0.01)，低劑量組與模型對(duì)照組比較具有顯著性差異(P=0.043，＜0.05)。通過免疫組化法檢測(cè)CPID模型大鼠子宮組織中粘連相關(guān)指標(biāo)TNF-α、ICAM-1的表達(dá)，

19、結(jié)果發(fā)現(xiàn):菝葜活性部位3個(gè)劑量組對(duì)TNF-α的高表達(dá)都有非常顯著地抑制作用，而對(duì)ICAM-1的抑制作用僅高劑量有非常顯著性差異(P＜0.01)，中、低劑量有顯著性差異(P＜0.05)。通過RT-PCR法對(duì)大鼠子宮TNF-α mRNA及ICAM-1 mRNA的表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示:各給藥組的TNF-αm RNA及ICAM-1mRNA的表達(dá)水平均較模型對(duì)照組下降，差異有極顯著性意義(P=0.000，＜0.001)，其中菝葜乙酸乙酯部位高、中劑

20、量組各指標(biāo)水平均已接近空白對(duì)照組水平(P=0.000，＜0.001)。本實(shí)驗(yàn)的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示:3個(gè)基因擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，熒光吸收?qǐng)D譜的S形曲線形狀完好，符合定量檢測(cè)要求;融解曲線呈單峰，峰形較銳利，未見其他峰值，提示各基因融解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，未見非特異的雙鏈DNA產(chǎn)物或引物二聚體。這說明本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR所得結(jié)果可靠。上述結(jié)果表明:本研究制備得到的菝葜活性部位對(duì)CPID的抑制作用可能通過抑制前炎癥性細(xì)胞因子T

21、NF-α和IL-1β，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10生成，同時(shí)抑制粘連相關(guān)的粘附分子ICAM-1等的表達(dá)與分泌有關(guān)。
　　 課題結(jié)論：
　　 綜上所述，本研究通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了菝葜的提取工藝，獲得菝葜醇提物及3個(gè)化學(xué)部位，隨后采用CPID大鼠模型、小鼠耳腫脹模型和大鼠棉球肉芽腫模型對(duì)上述提取物或化學(xué)部位進(jìn)行了藥效學(xué)研究，成功篩選出菝葜抗炎及抗CPID活性最強(qiáng)的部位為乙酸乙酯部位，再通過聚酰胺吸附樹脂對(duì)該化學(xué)部位進(jìn)一步純化，得

22、到菝葜活性部位，其總黃酮的含量達(dá)到55.7％。在CPID大鼠模型上對(duì)菝葜活性部位的藥理作用做進(jìn)一步的研究表明:菝葜活性部位可通過降低全血粘度、血漿粘度，緩解CPID大鼠血液高凝和高黏狀態(tài)，降低大鼠子宮粘連程度，降低毛細(xì)血管和細(xì)胞膜的通透性，減少炎癥滲出及抑制纖維結(jié)締組織增生，促進(jìn)炎癥吸收，從而發(fā)揮治療CPID的作用。機(jī)制研究表明，菝葜活性部位抗CPID作用可能與以下調(diào)節(jié)作用有關(guān):調(diào)節(jié)大鼠血清炎癥細(xì)胞因子，即降低促炎因子，升高抗炎因子，從