人真皮多潛能成纖維樣細胞向胰島分化的研究.pdf

1、種子細胞由于其供體來源和擴增能力有限，一直以來成為組織工程學發(fā)展的瓶頸。干細胞研究的發(fā)展，為尋找種子細胞來源帶來了轉機。骨髓基質干細胞便是其中的焦點，但仍面臨數量不足、造血干細胞損失等難題。位于人真皮層的成纖維細胞數量眾多、易于培養(yǎng)擴增。在以往的研究中，我們發(fā)現來源于人真皮層的成纖維細胞中存在著少量具有多向分化能力的多潛能細胞，這將成為組織干細胞家族中的新成員。為此，本課題擬對人真皮多潛能成纖維樣細胞的單細胞克隆進行進一步深入的研究，以

2、證實其是否具有多胚層分化的潛能，并探尋其向胰島樣細胞分化的能力，為治療I型糖尿病的胰島細胞移植提供一種新型的種子細胞來源。 目的: 本研究旨在揭示真皮多潛能成纖維樣細胞的干細胞特性，通過將真皮多潛能成纖維樣細胞的單細胞克隆在體外培養(yǎng)擴增后向脂肪、骨等中胚層誘導，向神經外胚層誘導，以及向肝臟內胚層誘導研究其是否具有多胚層分化的潛能；通過對真皮多潛能成纖維樣細胞單細胞克隆在體外向胰島樣細胞誘導分化后并將其植入糖尿病模型鼠體內

3、，研究其是否在體外、體內具有胰島樣細胞的特性及功能，為臨床I型糖尿病治療的胰島細胞移植提供一種新型的種子細胞來源。 方法: 我們從患者年齡在6-12歲的14例臨床包皮環(huán)切術后廢棄的正常皮膚組織中分離得到真皮成纖維樣細胞。通過有限稀釋法進行低密度接種，研究真皮多潛能成纖維樣細胞的單細胞克隆形成能力，并進一步挑選出單細胞克隆，在體外進行適量擴增后向中胚層、外胚層和內胚層分化。通過特殊染色和免疫熒光化學檢測等方法對誘導能力進行

4、鑒定。進一步將這些單細胞克隆在體外特定條件下向胰島樣細胞誘導分化，從形態(tài)學、蛋白質表達和基因水平上，對誘導后的細胞進行鑒定，并通過酶聯免疫分析法(ELISA)研究經誘導的細胞對適當濃度的葡萄糖刺激得反映。將在體外向胰島樣細胞誘導分化后的細胞與I型鼠尾膠原混合的細胞材料復合物移植到糖尿病裸鼠體內，在不同時間點觀測其體重和血糖的變化情況，研究其是否具有類似胰島的降血糖功能。 結果: 真皮多潛能成纖維樣細胞在體外低密度培養(yǎng)時具

5、有一定的克隆形成能力，經過5-6周的培養(yǎng)與擴增最終獲得61個真皮多潛能成纖維樣細胞單細胞克隆。細胞形態(tài)為長梭形。這些克隆在體外向中胚層誘導后，OilRed O檢測成脂肪誘導3周后可見到較多的脂肪細胞；經過成骨誘導后3周，ARS檢測顯示較多的鈣化結節(jié)成。向外胚層神經細胞誘導10天后，部分細胞形態(tài)出現多極化改變，細胞免疫熒光化學檢測到部分細胞有NF-M、NTR3及GAP-43的表達。向內胚層肝臟細胞誘導14天后，部分細胞形態(tài)出現鋪路石樣改變

6、，細胞免疫熒光化學檢測到部分細胞表達ALB及HNF-3β。61個單細胞克隆中，具有三胚層分化潛能的克隆的數量為兩個，占所有克隆個數的3.3％。具有三胚層分化潛能的單細胞克隆在體外特定條件下向內胚層胰島樣細胞誘導分化，兩周后細胞聚集形成類似胰島的團狀結構，免疫熒光化學檢測發(fā)現該團塊有胰島內分泌激素，如胰島素、胰高血糖素和SOM的表達，RT-PCR從基因水平上檢測到誘導后的細胞表達了胰島細胞分化過程中的相關基因，如：insulin、gluc

7、agon、ISL-1、PDX-1、NeuroD等，并能夠對適當濃度的葡萄糖刺激能夠產生應答，分泌胰島素。體外誘導分化的胰島樣細胞移植到糖尿病裸鼠體內后能在短期內明顯降低其血糖。證實了真皮多潛能成纖維樣細胞具有向胰島樣細胞分化的潛能，并能夠在體內發(fā)揮類似胰島的生理功能。 結論： 真皮多潛能成纖維樣細胞中存在著具有多胚層分化能力的干細胞，而且這種干細胞是一種可以向胰島樣細胞分化的全能干細胞，是組織工程領域中的一種新型種子細胞