納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、材料與方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　16個(gè)月清潔級(jí)雄性SD大鼠21只,體重352.1±23.5g。
　　2.實(shí)驗(yàn)藥品
　　鹽酸納洛酮注射液(Naloxone Hydrochloride Injection),商品名:金爾倫,Toluidine BlueO,鋨酸,醋酸雙氧鈾,吖啶橙,內(nèi)皮素放免試劑盒。
　　3.實(shí)驗(yàn)儀器
　　手動(dòng)腦薄片切片刀(美國Teyler實(shí)驗(yàn)室);PD-5微電

2、極拉制器(日本成貿(mào));SEN-7203三路電子刺激器(日本光電);MEN-8301微電極放大器(日本光電);SS-201J隔離器(日本光電);VC-11記憶示波器(日本成貿(mào));日立H300型透射電鏡,ACAS Ultima-312型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(Meridian Inc.美國);SN-682型γ-閃爍計(jì)數(shù)儀(上海原子核研究所)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1.動(dòng)物模型建立和分組
　　采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法

3、制備血管性癡呆大鼠。大鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)對(duì)照組,血管性癡呆組,血管性癡呆納洛酮治療組(每天0.8mg/kg納絡(luò)酮腹腔注射,連續(xù)7天)。每組均為7只大鼠。
　　2.Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)成績測試
　　包括Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)、可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn),觀察納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　3.海馬HE和Nissl染色
　　將大鼠左側(cè)腦組織置

4、于4％中性福爾馬林溶液中固定24小時(shí),常規(guī)石蠟包埋。每只動(dòng)物在矢狀縫旁1-4mm范圍內(nèi),等間隔取兩張4微米和四張厚6微米的矢狀面切片,分別行常規(guī)HE染色和Nissl染色。
　　4.血漿內(nèi)皮素水平測定
　　采用非平衡放射免疫法。
　　5.海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　游離海馬,迅速置于2%預(yù)冷的戊二醛溶液中固定。將海馬CA1區(qū)切成微小組織塊,鋨酸固定,脫水,樹脂包埋,醋酸雙氧鈾染色,透射電子顯微鏡觀察。
　

5、　6.海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的觀察
　　TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡。
　　7.海馬腦片Schaffer側(cè)枝至CA1通路長時(shí)程增強(qiáng)(Long Term Potentiation,LTP)的檢測
　　刺激電極置于海馬CA3區(qū)的Schaffer側(cè)枝處,記錄電極放置于CA1區(qū)錐體細(xì)胞處以記錄PS。強(qiáng)直刺激(Pulse50,burst3, main interval120s)后觀察PS相對(duì)于基線的變化。

6、>　　8.海馬錐體細(xì)胞DNA/RNA的檢測
　　激光共聚焦顯微鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的熒光強(qiáng)度,并用圖像分析技術(shù)進(jìn)行處理。
　　三、數(shù)據(jù)分析
　　所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,運(yùn)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行處理。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用雙因素重復(fù)測量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)和one-way ANOVA。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果：
　　一、納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠MWM成績的影響
　　1.隱匿平臺(tái)潛伏期
　　雙因素重復(fù)測量方差分析顯示納洛酮對(duì)三組大鼠的隱匿平臺(tái)逃避潛伏期有顯著的影響(P<0.001)。癡呆組大鼠的逃避潛伏期與假手術(shù)組和納洛酮組相比分別明顯延長(P<0.05),而納洛酮組大鼠的逃避潛伏期與假手術(shù)組大鼠的比較無顯著差異(P>0.05)。
　　2.空間探索實(shí)驗(yàn)
　　癡呆組大鼠穿越原隱匿平臺(tái)位置的探索次數(shù)最少(4.64±1

8、.73次/min)。納洛酮組大鼠的平均探索次數(shù)(8.36±1.38次/min)比癡呆大鼠顯著提高(P<0.001),但仍然低于假手術(shù)組(11.50±1.15次/min,P<0.01)。
　　3.可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)
　　假手術(shù)組、納洛酮組和癡呆組動(dòng)物的可見平臺(tái)逃避潛伏期未見明顯差異(P>0.05)。
　　二、納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠血漿內(nèi)皮素(endothelin,ET)水平的影響
　　癡呆組大鼠血漿ET水平(134.77

9、±20.76pg/ml)比假手術(shù)組(74.83±14.74pg/ml)顯著升高(P<0.01),納洛酮組大鼠 ET水平(102.61±28.53pg/ml)雖然也明顯高于假手術(shù)組(P<0.05),但比癡呆組大鼠顯著降低(P<0.05)。
　　三、納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)的影響
　　癡呆組大鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)(66.21±19.34)和納洛酮組的(101.68±20.06)與假手術(shù)組的(157.11±12

10、.27)相比分別顯著減少(P<0.01),其中納洛酮組大鼠的細(xì)胞數(shù)比癡呆組明顯增多(P<0.01)。
　　四、納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　癡呆組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞皺縮,核內(nèi)染色質(zhì)集聚成塊、邊集,形成不規(guī)則的高電子密度的團(tuán)塊位于細(xì)胞核周,核膜雙層結(jié)構(gòu)消失融散,胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。納洛酮組大鼠神經(jīng)元核膜雙層結(jié)構(gòu)存在,細(xì)胞皺縮,核內(nèi)染色質(zhì)集聚成塊、邊集現(xiàn)象明顯減少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善。

11、>　　五、納洛酮對(duì)血管性呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響
　　1.假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞偶見TUNEL陽性細(xì)胞,癡呆組和納洛酮組大鼠CA1區(qū)錐體細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)分別為(11.57±4.72)和(7.00±2.00)個(gè),比假手術(shù)組(1.57±2.64)明顯增多(P<0.01)。而納洛酮組大鼠又比 VD組大鼠顯著減少(P<0.05)。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測三組動(dòng)物的海馬細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(F=29.47,P<0

12、.001)。納洛酮組(5.64%±1.80%)和癡呆組大鼠(7.97%±1.47%)的凋亡率明顯高于假手術(shù)組(1.36%±1.62%,P<0.01),其中納洛酮組大鼠的凋亡率顯著低于癡呆組(P<0.05)。
　　六、納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP的影響
　　納洛酮治療組和假手術(shù)組大鼠被高頻刺激引發(fā)的PS增幅比VD組大鼠顯著增高(P<0.05)。而假手術(shù)組和納洛酮組大鼠的PS幅值相比無明顯差異(P>0.05)。<

13、br>　　七、納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠海馬錐體細(xì)胞核酸代謝的影響
　　癡呆組大鼠的DNA與RNA平均熒光強(qiáng)度的比值(1.87±0.73)比假手術(shù)組(2.84±0.84)和納洛酮組(3.79±2.37)顯著下降(P<0.01),而后兩者之間無明顯差異(P>0.05)。癡呆組大鼠錐體細(xì)胞的RNA熒光強(qiáng)度比假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)。納洛酮組大鼠的DNA熒光強(qiáng)度比假手術(shù)組和癡呆組顯著升高(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　

14、　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可得出以下結(jié)論:
　　1.本研究證明了納洛酮能夠提高血管性癡呆大鼠依賴于海馬的空間學(xué)習(xí)記憶能力。以往的研究提示納洛酮可以提高正常大鼠和嗎啡成癮大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,但對(duì)血管性癡呆的學(xué)習(xí)記憶的影響尚未見報(bào)道。
　　2.本研究證明了納洛酮能夠通過降低血管性癡呆大鼠升高的血漿內(nèi)皮素水平,減輕腦血管過度收縮。以往的研究發(fā)現(xiàn)納洛酮能夠降低顱腦外傷患者的血漿ET水平,尚未見到納洛酮對(duì)血管性癡呆大鼠血漿ET影響的報(bào)道。

15、
　　3.納洛酮可以減少血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的凋亡,并改善海馬神經(jīng)元的過度丟失。以往的研究提示納洛酮能夠阻斷嗎啡誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,但對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的影響未見報(bào)道。4.納洛酮提高血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū) Schaffer側(cè)枝的LTP。納洛酮可能通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的突觸可塑性,改善了血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　5.本研究證明了納洛酮能夠改善血管性癡呆大鼠海馬錐體細(xì)胞核酸代謝。以