小鼠哮喘氣道重構(gòu)形態(tài)計量學(xué)方法的初步建立及丹參水提液對氣道重構(gòu)的預(yù)防作用.pdf

1、第一部分：BALB/c小鼠支氣管樹鑄型的制作及哮喘氣道重構(gòu)形態(tài)計量學(xué)定位定量研究
　　 目的：
　　 建立BALB/c小鼠哮喘氣道重構(gòu)模型，確定該模型的肺組織形態(tài)計量學(xué)定位定量方法。
　　 方法：
　　 1、使用自凝造牙粉制作BALB/c小鼠的支氣管樹樹脂鑄型，確定肺組織形態(tài)學(xué)測量的具體部位。2、以卵白蛋白(OVA)致敏并激發(fā)的方法建立小鼠哮喘氣道重構(gòu)模型。檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞(

2、EOS)計數(shù)、白細胞介素-4(IL-4)、IL-13和干擾素-γ(IFN-γ)水平，病理切片HE染色觀察肺組織大體形態(tài)學(xué)改變。3、結(jié)合阿利辛藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色和Masson染色，以Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件在確定的目標部位測量上皮層厚度、平滑肌層厚度、杯狀細胞計數(shù)、杯狀細胞面積百分比、氣道旁和血管旁膠原蛋白沉積情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立的BALB/c小鼠支氣管樹鑄型能清晰呈現(xiàn)

3、支氣管樹結(jié)構(gòu)，為氣道重構(gòu)形態(tài)學(xué)定位提供了一個直觀的平臺。2、模型組小鼠的霧化激發(fā)時的急性哮喘癥狀，BALF中EOS計數(shù)明顯增加、IL-4、IL-13水平升高和IFN-γ水平顯著降低以及病理切片HE染色肺組織形態(tài)學(xué)改變均證實成功建立了哮喘氣道重構(gòu)模型。3、HE、AB-PAS和Masson染色目標部位測量的結(jié)果顯示模型組上皮層厚度、平滑肌層厚度、杯狀細胞計數(shù)、杯狀細胞面積百分比、氣道旁和血管旁膠原蛋白沉積測量值均顯著高于對照組(P<0.00

4、1)，且目標氣道周圍膠原沉積與氣道平滑肌厚度呈高度正相關(guān)(r=0.81，P<0.01)；血管周圍膠原蛋白沉積與支氣管周圍膠原沉積也存在高度正相關(guān)(r=0.89，P<0.01)，而炎癥細胞浸潤程度與支氣管周圍膠原沉積間呈線性正相關(guān)(r=0.75，P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 通過支氣管樹樹脂鑄型確定的目標支氣管能夠作為哮喘氣道重構(gòu)形態(tài)計量學(xué)分析的有效部位。結(jié)合Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量氣道重

5、構(gòu)的病理形態(tài)學(xué)改變的各個指標，驗證了該形態(tài)計量學(xué)定位定量方法的可行性和易行性。并通過該部位的測量進一步證明了氣道炎癥、膠原蛋白沉積和血管重塑在哮喘氣道重構(gòu)中起著重要作用。
　　 第二部分：丹參水提液對小鼠哮喘氣道重構(gòu)的預(yù)防作用
　　 目的：
　　 探討丹參水提液對小鼠哮喘氣道重構(gòu)的預(yù)防作用及其可能機制。
　　 方法：
　　 6周～8周齡雌性BALB/c小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。模型組(

6、OVA)：第0、7、14天給予0.5ml含10ugOVA和2.5mg氫氧化鋁凝膠的致敏液腹腔注射+多點皮下注射致敏，第21天開始霧化吸入1％OVA，每天一次，每次30min。第28天開始隔日霧化激發(fā)，連續(xù)8周；醋酸潑尼松(OVA+PA)組和丹參水提液高(OVA+DSH)、低劑量(OVA+DSL)組：致敏和激發(fā)同模型組，第28天開始每天灌胃給藥0.1ml/10g體重，隔日霧化激發(fā)前30min灌胃給藥，連續(xù)8周；對照組(CON)：以生理鹽水

7、代替OVA，其他同各預(yù)防給藥組。最后一次激發(fā)48h后處死小鼠，檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)、IL-4、IL-13和IFN-γ水平，病理切片結(jié)合AB-PAS染色和Masson染色，測量上皮層厚度、平滑肌層厚度、杯狀細胞計數(shù)、杯狀細胞面積百分比、氣道旁和血管旁膠原蛋白沉積情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.醋酸潑尼松預(yù)防給藥對哮喘氣道重構(gòu)的影響：
　　 (1)醋酸潑尼松對炎癥和細胞因子的影

8、響
　　 醋酸潑尼松(4mg·kg-1·d-1)預(yù)防給藥能顯著降低BALF中EOS計數(shù)、IL-4和IL-13的含量，達到對照組水平(P>0.05)，而BALF中IFN-γ的含量雖較模型組顯著增加(P<0.001)，仍低于對照組(P<0.01)；該組小鼠肺內(nèi)炎癥細胞浸潤明顯減少，但仍高于對照組(P<0.01)。
　　 (2)醋酸潑尼松對目標氣道形態(tài)學(xué)改變的影響
　　 預(yù)防性醋酸潑尼松灌胃給藥對哮喘小鼠氣道重構(gòu)形態(tài)學(xué)

9、改變產(chǎn)生了較明顯的干預(yù)作用，不僅顯著抑制哮喘時氣道的炎癥細胞浸潤，限制了慢性炎癥后續(xù)的氣道壁上皮層厚度增加，使其恢復(fù)至對照組水平(P>0.05)，而且使支氣管和血管周圍膠原沉積降至模型組的50％(P<0.001)；然而醋酸潑尼松對氣道平滑肌厚度增加的抑制作用卻不明顯，與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上皮杯狀細胞計數(shù)和杯狀細胞面積百分比與模型組相比均顯著降低(P<0.001)，但與對照組相比差異仍具有顯著性(P<0.001)。<

10、br>　　 2.丹參水提液預(yù)防給藥對哮喘氣道重構(gòu)的影響：
　　 (1)丹參水提液對炎癥和細胞因子的影響
　　 丹參水提液高(2.5g·kg-1·d-1生藥)預(yù)防給藥對氣道炎癥和炎癥介質(zhì)有明顯的抑制作用。雖然減少BALF中EOS計數(shù)的作用較醋酸潑尼松稍弱，但與模型組相比仍然效果顯著(P<0.001)，丹參水提液高劑量預(yù)防給藥后降低BALF中IL-4和IL-13含量的作用與醋酸潑尼松組無差別，并在增加IFN-γ含量上作用優(yōu)

11、于醋酸潑尼松組，幾乎達到對照組水平(P<0.05)。盡管該組肺組織炎癥細胞浸潤評分仍高與對照組(P<0.001)，但較模型組顯著降低(P<0.01)。
　　 丹參水提液低劑量(1.25g·kg-1·d-1生藥)預(yù)防給藥組對哮喘氣道炎癥和炎癥介質(zhì)的抑制作用較高劑量組弱。丹參水提液低劑量組BALF中EOS計數(shù)和IFN-γ的含量與模型組和對照組相比均有顯著性差異(P<0.001)，IL-4含量顯著低于模型組(P<0.001)，卻仍高于

12、對照組(P<0.01)，BALF中IL-13含量和肺組織炎癥細胞浸潤評分均僅稍低于模型組(P<0.05)，仍顯著高于對照組(P<0.001)。
　　 (2)丹參水提液對目標氣道形態(tài)學(xué)改變的影響
　　 丹參水提液高劑量預(yù)防給藥能夠顯著抑制哮喘氣道重構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變，目標氣道平滑肌層厚度和上皮層厚度較對照組均無增厚(P>0.05)；上皮杯狀細胞計數(shù)和杯狀細胞面積百分比雖較對照組顯著增加(P<0.001)，但明顯少于模型組(P<

13、0.001)。此外，該組目標氣道和血管周圍膠原蛋白沉積較對照組無明顯增多(P>0.05)。
　　 丹參水提液低劑量組目標氣道平滑肌層厚度與對照組間無差別(P>0.05)；上皮層厚度明顯低于模型組(P<0.01)，但仍較對照組高(P<0.05)；上皮杯狀細胞計數(shù)與對照組和模型組間均有顯著性差異(P<0.001)；上皮杯狀細胞面積百分比雖較明顯低于模型組(P<0.01)，但仍比對照組高(P<0.001)。丹參水提液低劑量預(yù)防給藥對血

14、管周圍膠原沉積的抑制作用不明顯(P>0.05)，支氣管周圍膠原沉積較模型組有所減少(P<0.01)，與對照組相比仍有顯著性差異(P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 在哮喘氣道重構(gòu)形成早期即應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或中藥丹參水提液預(yù)防性灌胃給藥，可明顯控制哮喘氣道炎癥，預(yù)防或延緩氣道重構(gòu)的發(fā)生，其中，丹參水提液在控制哮喘氣道炎癥方面的作用較糖皮質(zhì)激素稍弱，但其高劑量糾正Th1/Th2細胞因子平衡和抑制氣道重構(gòu)形態(tài)學(xué)改變的作用優(yōu)于