特異性增強(qiáng)心肌內(nèi)向整流鉀電流(I-,K1-)——抗心律失常新途徑.pdf

1、研究背景：目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物主要是阻斷心肌Na+、K+、Ca2+離子通道，但其致心律失常副作用也引起了普遍擔(dān)憂，尋找抗心律失常的新靶點(diǎn)和新機(jī)制一直是一個研究熱點(diǎn)。 Zacopride屬苯甲酰胺衍生物，兼有5-HT3受體抑制劑和5-HT4受體激動劑的性質(zhì)，作用于胃腸5-HT4受體促進(jìn)乙酰膽堿釋放，對實(shí)驗(yàn)動物胃腸道具有促動力作用。在一項(xiàng)比較50HT4受體激動劑西沙比利(cisapride)、RS67506和zacoprid

2、e致心律失常副作用的研究中發(fā)現(xiàn)，與西沙比利顯著的促心律失常副作用不同，zacopride對心律和心功能均無明顯影響。探究其作用的離子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，西沙比利和RS67506可抑制對大鼠心室肌IK1，而Zacopride對大鼠心室肌IK1表現(xiàn)出顯著的激動作用，對內(nèi)向電流和外向電流部分均有明顯增強(qiáng)效應(yīng)；同時表現(xiàn)出明確的通道選擇性，對ICa—L，INa，Ito，Isus，INa/Ca，Ipump等其他影響動作電位的主要離子流均無顯著作用。這提示我們

3、Zacopride很可能是IK1選擇性激動劑和潛在的抗心律失常藥物。 目的： 1．確證zacopride為大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道(IK1)特異性激動劑； 2．探討zacopride增強(qiáng)IK1可能的受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制； 3．建立大鼠心臟乳頭肌延遲后除極(DADs)和觸發(fā)活動(TA)模型，檢驗(yàn)zacopride對DADs和TA的影響； 4．建立大鼠離體和在體心律失常模型，檢驗(yàn)zacopride對多

4、種原因所致室性心律失常的影響； 5．應(yīng)用低濃度Ba2+(IK1相對特異性阻斷劑)對IK1的抑制作用，證實(shí)特異性增強(qiáng)IK1與抗心律失常效應(yīng)之間的關(guān)系。 方法： 1．采用膠原酶法急性分離大鼠(或豚鼠)左心室肌細(xì)胞。選用健康成年雄性SD大鼠(體重220～250g)或豚鼠(體重280～350g)，于術(shù)前15分鐘腹腔靜脈注射肝素(1000U/kg)，戊巴比妥鈉(65mg/kg，ip)麻醉后頸動脈放血，迅速開胸取出心臟，置于

5、4℃用100％氧氣飽和的無鈣臺氏液中修剪，然后將心臟懸掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動脈逆行灌流。先用無鈣臺氏液灌流8～10分鐘，再用膠原酶液循環(huán)灌流15～20分鐘。灌流過程中保持37℃恒溫，灌流壓80cmH2O，并持續(xù)通以100％氧氣。待心室肌組織變大、變軟后將左心室剪下，置于KB液中剪碎，輕輕吹打得到分散的左心室肌細(xì)胞，經(jīng)150μm孔徑的濾網(wǎng)過濾后保存于KB液中，室溫放置5～6小時后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先將存放于高鉀KB液中的

6、細(xì)胞逐步復(fù)鈣，然后取幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池(約1ml)，平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上靜置10min，待細(xì)胞充分貼壁后，用臺氏液灌流，流速為2ml/min。玻璃電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液，電阻約2～5MΩ。選取桿狀、橫紋清晰、無自主收縮的的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成高阻抗(＞1GΩ)封接后，用負(fù)壓破膜，進(jìn)行全細(xì)胞記錄。離子電流信號經(jīng)Axopatch200B膜片鉗放大器、Digidate1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器及Pclamp8.0采集、貯存及分析，并保

7、存在電腦硬盤中備用。 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在電流鉗模式下記錄靜息膜電位(RMP)和動作電位(AP)，在電壓鉗模式下記錄心肌細(xì)胞膜L—型鈣電流(ICa—L)、電壓門控鈉電流(INa)、內(nèi)向整流鉀電流(IK1)、瞬時外向鉀電流(Ito)、持續(xù)外向延遲整流鉀電流(Isus)、延遲整流鉀電流(IK，豚鼠)、鈉鈣交換電流(INa/Ca)、鈉鉀泵電流(Ipump)和ATP敏感鉀電流(KATP)。應(yīng)用電流密度(即單位膜電容的膜電流)表示膜電

8、流的大小。觀察①Zacopride對各離子通道的電流一電壓關(guān)系曲線(I-V曲線)的效應(yīng)；②Zacopride對IK1作用的最大增幅、最大效應(yīng)濃度以及能抵消zacopride對IK1最大增強(qiáng)效應(yīng)的BaCl2濃度(用于第4部分離體心臟灌流模型的研究)；③Zacopride對靜息膜電位、動作電位幅度和時程的影響。④Zacopride對靜息膜電位和IK1作用的時間過程。 2．應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，分別觀察10μmol/L5-HT4受體阻斷劑R

9、S23597-190，10μmol/L5-HT3受體激動劑m—chlorophenylbiguanide，5μmol/LPKA抑制劑KT5720，5μmol/LPKC抑制劑GF109203x和5μmol/LPKG抑制劑KT5823對zacopride增強(qiáng)IK1作用的影響。 3．在大鼠乳頭肌建立DADs和TA的模型。取健康雄性SD大鼠14只，體重220～250克，戊巴比妥鈉按65mg/kg腹腔麻醉后迅速開胸取出心臟，浸入100％O

10、2飽和的冰臺氏液中洗凈殘血，沿前室間溝左緣剪開左室，小心切取5～6mm長，2～3mm寬的左室乳頭肌，置于組織灌流槽中，用不銹鋼針固定于槽底的硅膠板上。標(biāo)本以95％O2-5％CO2混合氣體平衡的臺氏液循環(huán)灌流。以多導(dǎo)電子刺激器產(chǎn)生的串刺激作為誘發(fā)DADs和TA的條件刺激，每個串刺激為6個連續(xù)脈沖，脈沖周期長度(BCL)為200ms，脈寬2ms，強(qiáng)度為2倍閾值。玻璃電極內(nèi)充以3mmoo/LKCl，電阻10～20MΩ。穩(wěn)定1小時后，使用三維液

11、壓式微操縱器將微電極插入單個心肌細(xì)胞內(nèi)，引出正常動作電位。之后于灌流液中加入異丙腎上腺素(終濃度1μmol/L)，采用上述條件刺激誘發(fā)DADs和TA。Zacopride預(yù)處理組則預(yù)先用zacopride(基于膜片鉗結(jié)果，濃度為激活I(lǐng)K1最大效應(yīng)濃度)灌流組織，10分鐘后再給予異丙腎上腺素，用藥前后采用相同的條件刺激誘發(fā)DADs和TA，觀察zacopride對異丙腎上腺素誘發(fā)DADs和TA的影響，比較兩組DADs和TA的發(fā)生率。

12、4．Zacopride對多種心律失常模型的效應(yīng)。 (1)大鼠離體心臟心律失常模型: 1)離體心臟缺血性或再灌注性心律失常模型。 實(shí)驗(yàn)分組：①單純?nèi)毖M(對照組)或單純?nèi)毖俟嘧⒔M(對照組)；②缺血(或再灌注)+Zacopride不同濃度組；③缺血+Zacopride+BaCl2組。 2)離體心臟烏頭堿心律失常模型。 造模方法：大鼠，麻醉，開胸，取出心臟行Langendorff主動脈逆行灌流，記錄心

13、電圖。 實(shí)驗(yàn)分組：①給藥組(n=8)；②對照組(n=8)。 觀測指標(biāo)：比較烏頭堿中毒對照組與zacopride處理組室性心律失常(包括室早、室速、室顫)的持續(xù)時間。 (2)大鼠在體心律失常模型： 1)在體缺血性或再灌注性心律失常。 造模方法：SD大鼠，麻醉，開胸，記錄心電圖，結(jié)扎冠脈左前降支，局部缺血15分鐘，松扎后再灌注15分鐘。不同劑量的Zacopride或Lidocaine7.5mg/kg于

14、缺血前或再灌注前3分鐘由股靜脈注射，觀測量效關(guān)系。 觀測指標(biāo)：分別累計(jì)缺血后15分鐘和再灌注后15分鐘內(nèi)心律失常潛伏期，期前收縮次數(shù)，室速持續(xù)時間和發(fā)生率，室顫持續(xù)時間和發(fā)生率。 2)在體烏頭堿心律失常模型。 造模方法：SD大鼠，麻醉，記錄心電圖，在3秒內(nèi)由舌下靜脈一次性注射烏頭堿30μg/kg，誘導(dǎo)出穩(wěn)定的心律失常。Zacopride處理組在注射烏頭堿后立即由股靜脈注射zacopride。 觀測指標(biāo)：比

15、較烏頭堿中毒組與zacopride給藥組室性心律失常(包括室早、室速、室顫)的持續(xù)時間。 結(jié)論： 1．zacopride為大鼠心室肌IK1特異性激動劑，在0.1～10μmol/L范圍內(nèi)，可顯著增強(qiáng)IK1；相同濃度范圍的zacopride對大鼠ICa—L、INa、Ito、Isus、INa/Ca、Ipump、KATP和豚鼠IK均無顯著影響。 2．在0.1～10μmol/L范圍內(nèi)，Zacopride可顯著增大(超極化)

16、靜息電位，增加動作電位幅度，縮短動作電位時程。 3．Zacopride對IK1的激動作用經(jīng)由PKA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其效應(yīng)不依賴于5-HT3和5-HT4受體。 4．zacopride可有效抑制異丙腎上腺素誘發(fā)的延遲后除極和觸發(fā)活動。 5．zacopride對大鼠心臟缺血性、再灌注性及烏頭堿中毒所致的心律失常均有明顯抑制作用，其抗心律失常效應(yīng)主要由藥物增強(qiáng)心室肌細(xì)胞IK1所介導(dǎo)；zacopride對缺血性和再灌注