脂肪來源干細(xì)胞在整形外科的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：建立兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，鑒定并分析其生物學(xué)特性，并探索脂肪組織來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)的最佳條件。觀察大鼠自體脂肪來源干細(xì)胞的皮下移植成活的情況。嘗試用兔脂肪來源干細(xì)胞來解決擴(kuò)張皮瓣淤血問題。探索脂肪來源干細(xì)胞在人體體表軟組織缺損復(fù)合脂肪組織移植的臨床應(yīng)用。觀察人脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合脂肪移植人體表軟組織缺損臨床效果。
　　 方法：①選用新西蘭大白兔，無菌取出腹股溝脂肪，膠原酶法分離出兔脂肪干細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，

2、取2代以后的兔脂肪干細(xì)胞觀察其形態(tài)特征，并繪制細(xì)胞生長曲線及倍增時(shí)問。比較了不同膠原酶濃度、膠原酶消化時(shí)間和血清濃度對于脂肪來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)的不同效果。②60只Vistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，實(shí)驗(yàn)組取自體腹股溝區(qū)皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后用脂質(zhì)體法對細(xì)胞進(jìn)行eGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)對照組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染標(biāo)記后，利用G418將細(xì)胞其滅活?？瞻讓φ战M為生理鹽水。分別將其

3、注射移植至大鼠自體耳廓皮下層次，分別于注射后第2、4、6周時(shí)進(jìn)行冰凍切片觀察并定量分析所形成組織量的轉(zhuǎn)歸情況。③20只新西蘭大耳白，左耳、右耳隨機(jī)排列，10ml擴(kuò)張器在耳背皮下植入，定期注水，于第20天取出擴(kuò)張器，并形成皮瓣，制做淤血模型。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組取自體腹股溝區(qū)皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法提取脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后對細(xì)胞Dil染色標(biāo)記?？瞻讓φ战M為生理鹽水。分別將其注射移植至兔形成皮瓣的皮下層次，在注射后于第2周時(shí)

4、觀察皮瓣的成活情況，并進(jìn)行病理切片觀察和CD34兔疫組織化學(xué)染色，定量分析所形成組織量的成活情況和血管發(fā)生情況。2008年4月至2010年4月共收治體表軟組織缺損患者共12例，病因有放療遺留軟組織萎縮、手術(shù)遺留缺損、年齡老化致鼻唇溝加深、眉間紋加深等。與患者交流后，都愿意嘗試脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合脂肪移植填充體表軟組織缺損。局部腫脹麻醉下，取自體腹部或雙側(cè)大腿皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，濃集(2×106/ml)后即

5、時(shí)與自體脂肪混合靜置半小時(shí)后注射移植，采用多點(diǎn)、多層次、少量多次的注射方法，術(shù)后適度加壓包扎。
　　 結(jié)果：①兔脂肪干細(xì)胞原代及傳代細(xì)胞形態(tài)：原代及傳代的兔脂肪干細(xì)胞均呈長梭形或多邊形貼壁生長，生長分化活躍。②兔脂肪干細(xì)胞的生長曲線及倍增時(shí)間：傳代的兔脂肪干細(xì)胞生長曲線呈“s”形，倍增時(shí)間為55 h。③兔脂肪干細(xì)胞的成脂分化誘導(dǎo)，經(jīng)油紅染色的辦法，其成脂分化的陽性率為65％。④采用0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml

6、、2mg/ml四種不同膠原酶濃度進(jìn)行消化后發(fā)現(xiàn)，在消化時(shí)間為1h時(shí)，2mg/ml組細(xì)胞總數(shù)最多，活細(xì)胞比率與其他組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在消化時(shí)間為2h時(shí)，細(xì)胞總數(shù)較1h各組均增加，同時(shí)，1mg/ml組、1.5mg/ml組和2mg/ml組消化細(xì)胞總數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，活細(xì)胞比率1mg/ml組和1.5mg/ml組最高。采用5％、10％、15％、20％五種不同血清濃度培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，15％和20％組生長特性最佳，明顯優(yōu)于另三組。④實(shí)驗(yàn)組切片內(nèi)可見明顯綠色熒

7、光組織層存留，其體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒有明顯的變化。(P＜0.01)⑤實(shí)驗(yàn)組皮瓣成活的長度明顯長于對照組，病理切片顯示CD34染色密度明顯高于對照組。(P＜0.01)。術(shù)后半年隨訪填充脂肪維持注射量，無明顯吸收。
　　 結(jié)論：①本次實(shí)驗(yàn)所分離出來的兔脂肪干細(xì)胞在體外具有生長穩(wěn)定，增殖較快的特點(diǎn)。脂肪組織來源干細(xì)胞，膠原酶濃度1mg/ml、消化時(shí)間2h、血清濃度15％是最佳的培養(yǎng)條件。②單純自體脂肪來源干細(xì)胞的皮下移植可以存活，并且形