血清中可溶性B7-H1檢測(cè)方法的建立及臨床意義研究.pdf

1、目的：B7-H1是B7共刺激分子家族的成員之一，在正常的組織表面幾乎不表達(dá)，但在腫瘤組織確是高表達(dá)的，而且腫瘤組織表面的組成型B7-H1的表達(dá)還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。B7-H1通過(guò)與其抑制性受體結(jié)合，分別在初始T細(xì)胞的初級(jí)反應(yīng)階段和活化階段，記憶性T細(xì)胞的再次反應(yīng)階段起到重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。B7-H1可誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性CTL的凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用，在腫瘤的免疫逃逸、多藥耐藥、病毒感染、炎癥、自身免疫疾病和移植物耐受等多

2、種病理情況下發(fā)揮著重要作用，是腫瘤的潛在靶標(biāo)和治療靶點(diǎn)。由于目前對(duì)B7-H1的研究均限于細(xì)胞或組織表面組成型表達(dá)的B7-H1分子，而我們的預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中有可溶性B7-H1的表達(dá)，本課題擬通過(guò)證實(shí)血清中B7-H1可溶性片段的存在，探討其功能和與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性；由于市售抗B7-H1單抗僅有一種，我們通過(guò)制備B7-H1的單克隆抗體，建立較為簡(jiǎn)便的B7-H1的夾心ELISA血清學(xué)臨床檢測(cè)方法。
　　方法：首先，我們通過(guò)

3、B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備鼠抗人B7-H1單克隆抗體，為檢測(cè)血清中可溶性B7-H1片段奠定基礎(chǔ)。然后，我們將SP2/0細(xì)胞皮下注射Babl/c小鼠，構(gòu)建實(shí)體瘤模型，通過(guò)以下方法檢測(cè)荷瘤小鼠的血清中可溶性B7-H1的表達(dá)：（1）采用Dotblot方法確定荷瘤小鼠血清中是否含有可溶性B7-H1；（2）采用Westernblot方法鑒定可溶性B7-H1的分子量，以及其相對(duì)含量和小鼠荷瘤時(shí)間、瘤重的相關(guān)性，為研究腫瘤患者的可溶性B7-H1與其病程的相

4、關(guān)性提供依據(jù)。最后，對(duì)肺癌患者血清及組織中可溶性和組成型的B7-H1進(jìn)行了檢測(cè)，包括：（1）采用Dotblot方法確定肺癌患者血清中是否含有可溶性B7-H1片段；（2）采用Westernblot方法確定可溶性B7-H1片段的分子量；（3）建立可溶性B7-H1的夾心ELISA臨床檢測(cè)方法，并對(duì)10例腫瘤患者血清的可溶性B7-H1含量進(jìn)行測(cè)定。（4）對(duì)肺癌病人的腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色以確定其有組成型B7-H1的表達(dá)。
　　結(jié)果：用人

5、源性B7-H1IgV樣區(qū)混合佐劑免疫Babl/c小鼠，最終獲得了一株高親和力的單克隆抗體。對(duì)荷瘤小鼠的血清檢測(cè)結(jié)果：（1）Dotblot結(jié)果顯示荷瘤小鼠血清中確含有可溶性B7-H1片段，且不同個(gè)體的含量不同；（2）Westernblot結(jié)果顯示，可溶性片段的分子量約為37kD，但其相對(duì)含量與荷瘤時(shí)間和瘤重?zé)o明顯相關(guān)性。對(duì)肺癌患者血清和腫瘤組織的檢測(cè)：（1）Dotblot結(jié)果顯示肺癌患者血清中確含有可溶性B7-H1片段，且不同個(gè)體的含量不

6、同；（2）Westernblot結(jié)果顯示，可溶性片段的分子量約為42kD；（3）建立了夾心ELISA檢測(cè)血清中可溶性B7-H1含量的檢測(cè)方法，并分析10例患者血清中可溶性B7-H1的含量，但由于缺少臨床病例資料，暫時(shí)還無(wú)法對(duì)此含量和癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系作出評(píng)價(jià)；（4）對(duì)采血對(duì)象的腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤組織胞漿中有組成型的B7-H1表達(dá)。
　　結(jié)論：成功地制備了一株單克隆抗體。建立了血清可溶性B7-H1的檢測(cè)方法，并成功證實(shí)了