以ABCA1為靶點的新型抗動脈粥樣硬化藥物篩選模型的構建與應用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是缺血性心腦血管疾病共同的病理生理基礎，而外周細胞內膽固醇代謝障礙是動脈粥樣硬化的重要發(fā)病機制。過量膽固醇從肝外組織中的清除是預防和治療AS的關鍵步驟。ATP結合盒轉運體A1(ABCA1)是ATP結合盒轉運體超家族成員之一，是一種重要的以ATP為能源轉運各種離了、脂類等細胞代謝物的膜轉運蛋白。ABCA1可介導細胞內磷脂和游離膽固醇轉運至貧脂或無脂的載脂蛋白A-I(apoA-I)，從而促進高密度脂蛋白(HDL)生成，啟

2、動膽固醇逆轉運過程，在機體清除多余脂質的過程中發(fā)揮重要作用。ABCA1基因突變可導致嚴重的HDL缺乏綜合癥-Tangier Disease(TD)，患者以血漿HDL及apoA-I嚴重缺乏和組織巨噬細胞內膽固醇酯增多為主要特征，常伴有高膽固醇血癥、心血管疾病和AS。對轉基因小鼠的研究表明ABCA1過度表達使apoA-I介導的膽固醇流出明顯增加，血漿HDL水平顯著升高，而且ABCA1蛋白水平與膽固醇流出增加及HDL水平升高明顯相關。因此，以

3、ABCA1為靶點篩選得到其表達上調劑，不僅將加深我們對真核牛物ABCA1基因表達調控及其牛物學意義的理解，揭示膽固醇逆轉運調控關鍵環(huán)節(jié)，而且對新型抗動脈粥樣硬化藥物的開發(fā)也具有指導意義。 為了尋找能夠提高ABCA1表達水平的活性化合物，本工作構建了一個新穎的以細胞為基礎的高通量篩選模型。將在熒光素酶報告基因上游克隆有ABCA1基因上游調控序列的重組質粒pGL3-ABCA1與pcDNA3共轉染人肝癌細胞HepG2，經(jīng)Gg18篩選得

4、到穩(wěn)定轉染細胞株，命名為ABCA1-LUC HepG2細胞。以9-順式-視黃酸為陽性對照，利用ABCA1-LUC HepG2胞株建立了ABCA1表達上調劑篩選模型。對該模型進行了條件優(yōu)化和高通量篩選適應性評價，結果表明所選的文獻報道陽性藥物在此基于細胞的高通量篩選模型中都呈現(xiàn)良好的量效關系和較高的信噪比，而且用于評價模型穩(wěn)定性的參數(shù)Z'因子>0.5，從而證明了所建模型具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。應用本模型對4000個微生物發(fā)酵液粗提物和2

5、200個天然產物與合成化合物進行了8200樣次的篩選，經(jīng)過初篩和復篩，獲得了具有ABCA1表達上調活性的3個陽性菌株和7陽性個化合物。對兩株陽性菌株I05-1143和I05-1743進行了生物學鑒定、發(fā)酵條件摸索和發(fā)酵液活性成分的分離與性質的初步研究。從I05-1743發(fā)酵液中得到一個活性組分，命名為組分1743A；從I05-1143發(fā)酵液分離得到的一個單體化合物1143A，并進行了結構鑒定，確證1143A為4’,7-二羥基異黃酮，與已

6、知化合物大豆素結構相同。對篩選得到的4個天然活性產物：吡咯霉素(2006-F7)、阿克拉霉素(2008-F4)、大豆素(1143A)和紅車軸草素(4776B)進行了分子藥理學及細胞水平牛物活性研究。研究結果表明吡咯霉素、阿克拉霉素、大豆素和紅車軸草素都能在微摩爾濃度下上調ABCA1的轉錄活性，最大上調倍數(shù)在1.8～2.5倍之間。采用Real-time quantitative RT-PCR和Western blot方法進一步證實了4個活

7、性化合物對HepG2細胞中ABCA1轉錄和翻譯水平的影響。利用小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7泡沫化實驗結果顯示，吡咯霉素、阿克拉霉素、大豆素和紅車軸草素對巨噬細胞的泡沫化具有一定的抑制作用。 本研究首次構建了適于高通量篩選的ABCA1表達上調劑篩選模型，通過篩選和分離純化獲得了8個具有上調ABCA1表達活性的化合物，并在分子和細胞水平確證了其牛物學活性，為尋找新型抗動脈粥樣硬化藥物或其先導化合物奠定了基礎，同時使利用小分了化