轉(zhuǎn)Bt基因水稻對土壤微生物的影響及稻田二化螟遺傳多樣性研究方法的建立.pdf

1、水稻等主糧轉(zhuǎn)基因育種具有對目標性狀定向變異、育種周期短等諸多優(yōu)點，但食品安全與生態(tài)安全等方面的基礎研究工作有待深入、廣泛開展，這方面的研究將有助于轉(zhuǎn)基因作物穩(wěn)妥、科學、安全地推廣應用。
　　本研究擬采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和高通量測序技術研究稻田土壤微生物尤其是土壤重要功能微生物對轉(zhuǎn)Bt基因水稻的響應?；赟anger測序技術和PCR-DGGE技術，建立了兩種轉(zhuǎn)基因稻田昆蟲遺傳多樣性的研究方法。
　　基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，對種植轉(zhuǎn)Bt基

2、因水稻及其親本稻的稻田土壤微生物的豐度進行連續(xù)兩年的追蹤，實驗結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)基因水稻種植稻田細菌豐度變化范圍在3.28-17.7×106 CFU/g干土，真菌豐度變化范圍在2.56-8.09×104 CFU/g干土，放線菌豐度變化范圍在0.36-4.52×106 CFU/g干土；轉(zhuǎn)基因組細菌豐度變化范圍在3.01-15.2×106 CFU/g干土，真菌豐度變化范圍在2.13-12.4×104 CFU/g干土，放線菌豐度變化范圍在0.31

3、-3.9×106 CFU/g干土。轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因組間的差異不具有統(tǒng)計學意義。
　　基于454焦磷酸測序技術，分別對細菌16S V1-V3區(qū)和真菌ITS ITS1-ITS4區(qū)進行了測序，兩年共得到498378條細菌有效序列，765283條真菌有效序列。基于2012年測序結(jié)果比對分析確定95屬細菌，確定182屬真菌。非轉(zhuǎn)基因稻田土壤細菌群落的Chao和Shannon指數(shù)分別為1965.33和6.67234，真菌的Chao和Shann

4、on指數(shù)分別為1654.23和3.791402；轉(zhuǎn)基因組土壤細菌Chao和Shannon指數(shù)分別為1798.35和5.95488，真菌的Chao和Shannon指數(shù)分別為1792.38和3.69263，兩組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異?；?013年測序結(jié)果，確定104屬細菌，確定151屬真菌，比較分析轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組之間的Chao、Shannon等指數(shù)，兩組間也未發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　研究Anaeromyxobacter、Nitraspi

5、ra、Dactylella等重要土壤功能細菌和真菌對轉(zhuǎn) Bt基因水稻的響應，分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因組中Anaeromyxobacter、Nitraspira、Thiobacillus三個屬在樣品中所占的比例大于非轉(zhuǎn)基因組，Dactylella、Taifanglania兩個屬在樣品中所占的比例小于非轉(zhuǎn)基因組，但這種差異不明顯。
　　本研究工作采集了湖南、江西兩地稻田各30只二化螟樣本，并從中各隨機選擇了12個樣本進行了研究，通過二化螟樣本

6、的COⅠ基因的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，COⅠ基因的35~692 bp區(qū)段存在豐富的多態(tài)（在658個堿基中檢測到173個多態(tài)位點），因此該區(qū)段非常適合開展二化螟種群遺傳多樣性的分析。結(jié)合COⅠ基因序列數(shù)據(jù)，本研究自行設計了可用于DGGE分析的引物，使用PCR-DGGE來研究二化螟的遺傳多樣性。DGGE指紋圖譜與常規(guī)測序數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果基本一致。
　　本工作獲得的轉(zhuǎn)基因稻田的可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物數(shù)據(jù)，為下一步深入研究轉(zhuǎn)Bt基