懷牛膝連作促進(jìn)效應(yīng)及其分子機(jī)理研究.pdf

1、本研究在實(shí)地調(diào)查懷牛膝具有很強(qiáng)的化感連作促進(jìn)作用的基礎(chǔ)上，采集連作多年懷牛膝土壤，運(yùn)用生物測(cè)試方法、抑制消減雜交技術(shù)和差異蛋白質(zhì)組學(xué)，探討連作多年懷牛膝土壤的化感物質(zhì)對(duì)下茬懷牛膝的連作促進(jìn)效應(yīng)及其作用機(jī)理。其結(jié)果如下： 通過水浸提和有機(jī)溶劑萃取法得到連作多年懷牛膝土壤的化感物質(zhì)，應(yīng)用培養(yǎng)皿-濾紙生物測(cè)試法進(jìn)行連作化感物質(zhì)對(duì)模式植物萵苣的作用效果分析。結(jié)果顯示，連作土壤的化感物質(zhì)對(duì)模式植物萵苣的生長促進(jìn)效果明顯，各處理對(duì)萵苣的作用

2、率(Effect rate，ER)均大于25％，尤其是水浸提處理的作用效果最明顯，其促進(jìn)率大于100％。在生物測(cè)試基礎(chǔ)上優(yōu)選出了三個(gè)水浸提處理濃度進(jìn)行懷牛膝連作模擬，探討連作多年懷牛膝土壤的化感物質(zhì)所引起下茬懷牛膝在基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯水平上的表達(dá)差異，及其對(duì)下茬懷牛膝促進(jìn)生長的分子機(jī)理。 抑制消減雜交技術(shù)分析結(jié)果顯示，懷牛膝根系分泌物能明顯誘導(dǎo)下茬懷牛膝的基因差異表達(dá)。通過SSH技術(shù)構(gòu)建了懷牛膝在連作條件下的正向SSH-cDN

3、A文庫，通過菌液PCR、質(zhì)粒驗(yàn)證和反向Northen雜交驗(yàn)證后共得到45個(gè)陽性克隆。經(jīng)過cDNA測(cè)序，除去部分重復(fù)序列和未知序列后得到10個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因。差異片段有參與植物光合作用相關(guān)的基因片段和基因表達(dá)調(diào)控的基因片段，還檢測(cè)到與植物甾醇和黃酮類合成相關(guān)的基因片段，也有參與糖基化轉(zhuǎn)運(yùn)的基因片段。抑制消減雜交技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上揭示了連作多年懷牛膝土壤的化感物質(zhì)能明顯促進(jìn)下茬懷牛膝的初級(jí)代謝過程，并能激發(fā)植物甾醇類和黃酮類物質(zhì)代謝，這可能是

4、懷牛膝連作化感促進(jìn)作用的一個(gè)重要的因素。 進(jìn)一步，運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示：連作土壤水浸提液處理懷牛膝幼苗能明顯誘導(dǎo)其機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的特異表達(dá)，具體表現(xiàn)在共有25個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)豐度發(fā)生明顯變化，其中15個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，10個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生下調(diào)，這些蛋白質(zhì)主要與植物的營養(yǎng)吸收代謝，植物次生代謝和抗逆性，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及核酸與蛋白質(zhì)的合成相關(guān)。從上調(diào)的蛋白而言，有與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的如F-BOX、生長素誘導(dǎo)蛋白和生長素響應(yīng)蛋白，有

5、與植物抗性和內(nèi)源次生代謝相關(guān)的如茶爾酮合成酶、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶等，有與植物營養(yǎng)代謝相關(guān)如磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶激酶、K-ATP轉(zhuǎn)移酶等；而發(fā)生下調(diào)的蛋白質(zhì)有與植物氮素利用相關(guān)的如丙酮酸脫氫酶激酶和谷氨酰胺合成酶等?？梢?，連作化感物質(zhì)不僅誘導(dǎo)了下茬懷牛膝體內(nèi)甾醇類和黃酮類物質(zhì)代謝過程，還能明顯激發(fā)機(jī)體內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)，誘導(dǎo)生長素類激素的分泌，進(jìn)而促進(jìn)下茬懷牛膝對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和物質(zhì)合成，并調(diào)節(jié)次生代謝物質(zhì)的分配運(yùn)輸，從而促進(jìn)懷牛

6、膝的根部膨大和藥用活性成分在根部的累積，進(jìn)而提高懷牛膝的品質(zhì)和產(chǎn)量。 由此本文認(rèn)為，前茬懷牛膝機(jī)體代謝形成的化感物質(zhì)在土壤中累積，也可能經(jīng)過內(nèi)生微生物或土壤中微生物轉(zhuǎn)化和放大作用積累于土壤，會(huì)激發(fā)下茬懷牛膝機(jī)體內(nèi)的某種信號(hào)系統(tǒng)，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯，在代謝水平上作出響應(yīng)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的激素水平，利用激素調(diào)節(jié)從分子水平上活化懷牛膝機(jī)體細(xì)胞分裂和生長提高懷牛膝對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用和機(jī)體合成物質(zhì)的分配運(yùn)輸，從而調(diào)節(jié)懷牛膝生