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文檔簡介
1、研究背景:
蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)外科急危重癥,約占全部腦卒中的5%~10%,其中85%的出血原因為顱內(nèi)動脈瘤破裂。盡管診斷方法、血管介入、手術(shù)夾閉、以及圍手術(shù)期處理等臨床手段較前取得了巨大的進(jìn)步,大大降低了動脈瘤破裂再出血的發(fā)生率,但SAH的致死率和致殘率未獲得明顯降低,其對社會經(jīng)濟造成的負(fù)擔(dān)巨大。過去四十年來,腦血管痙攣一直被認(rèn)為是導(dǎo)致高死亡和高
2、致殘的主要因素,可惜,針對腦血管痙攣的治療臨床上并未獲得成功。近期越來越多的證據(jù)提示:腦血管痙攣可能只是SAH的病理因素之一,甚至可能僅僅只是SAH后期的臨床表現(xiàn)。事實上,多種腦損傷機制共同參與了SAH的病理生理過程,包括早期腦損傷(Early brain injury,EBI),皮層去極化和微循環(huán)障礙等。它們相互作用,共同導(dǎo)致了SAH災(zāi)難性的結(jié)局。其中,國際卒中學(xué)術(shù)界已經(jīng)逐漸接受了EBI是SAH致死致殘的主要原因。
新概念E
3、BI指從SAH后72小時以內(nèi)發(fā)生的一系列腦損傷。目前,對EBI病理生理機制已有了初步的認(rèn)識,主要包括動脈瘤破裂后的機械性損傷、顱內(nèi)壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓下降、大腦皮質(zhì)的廣泛去極化、細(xì)胞凋亡和壞死、自噬作用、離子穩(wěn)態(tài)的破壞、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞、及腦水腫等,但具體的損傷機制及信號通路需要進(jìn)一步的探索研究。
炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡是EBI機制研究的熱點。多種炎癥通路已在SAH后EBI中激活。SAH患者血液及腦脊液中的炎癥因
4、子水平與患者的損傷程度及預(yù)后密切相關(guān)。白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)是參與EBI的主要炎癥因子,但其在SAH腦內(nèi)準(zhǔn)確的來源及具體的生成釋放機制仍不清楚。Cryopyrin炎癥小體能夠識別來自病原相關(guān)分子模式或者宿主來源的危險信號分子的信號,招募促炎癥蛋白酶caspase-1并致其自我激活?;罨腸aspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體,產(chǎn)生成熟IL-1β和IL-18。P2X7受體(P2X7 recept
5、or, P2X7R)是cryopyrin炎癥小體的上游分子。P2X7R激活導(dǎo)致的K+外流是cryopyrin炎癥小體激活的主要機制之一。目前,尚無P2X7R和cryopyrin炎癥小體在SAH中臨床和實驗研究。
SAH發(fā)生后,腦內(nèi)廣泛區(qū)域神經(jīng)元發(fā)生凋亡,并導(dǎo)致腦損傷。動物實驗已證實:減少神經(jīng)元凋亡可以明顯改善SAH造成的神經(jīng)功能損傷。促凋亡因子和抗凋亡因子及其上游信號通路共同參與了SAH后凋亡反應(yīng)的整個過程。其中,活化的cas
6、pase-3是誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的核心,也是凋亡反應(yīng)的真正執(zhí)行者。抑制caspase-3的激活對治療SAH至關(guān)重要。前期研究發(fā)現(xiàn):P2X7R可以調(diào)控caspase-3的活性。因此,本課題推測阻斷P2X7R的激活可以緩解SAH后神經(jīng)元的凋亡,從而改善SAH后的神經(jīng)功能,并探索其中相應(yīng)的病理機制。
SAH能夠引起全身炎癥反應(yīng)綜合征,并發(fā)急性多器官功能障礙,表現(xiàn)為心臟驟停,肺、腎等臟器損傷,和胃腸反應(yīng)等。神經(jīng)源性肺水腫增加SAH患者的死
7、亡率,但是,其發(fā)生具體的機制和治療手段尚不明確。目前,全身炎癥反應(yīng)和肺血管壓力升高是兩種可能的主要機制。P2X7R在肺組織的多種細(xì)胞膜上廣泛表達(dá),并于炎癥反應(yīng)密切相關(guān),因此,本課題推測P2X7R可能參與了SAH引發(fā)的神經(jīng)源性肺水腫(Neurogenicpulmonary edema,NPE),目前國內(nèi)外尚未開展相關(guān)研究。
近年來,研究提示P2X7R參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程,作用廣泛而且非常重要。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)
8、上,探索P2X7R阻斷劑能否減輕SAH后EBI和非神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,其保護(hù)作用是否與抗炎,抗凋亡和緩解NPE有關(guān)。
1.P2X7R/Cryopyrin炎癥小體在蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥發(fā)生中的作用
研究目的:
本部分實驗檢測大鼠SAH后P2X7受體,cryopyrin炎癥小體的組件(cryopyrin,apoptosis-associated speck-like protein containing a CAR
9、D(ASC),caspase-1前體)及下游的炎癥因子的表達(dá),包括成熟IL-1β和IL-18;了解P2X7R/cryopyrin炎癥小體信號通路在SAH炎癥反應(yīng)中的作用,并進(jìn)一步闡明炎癥對SAH神經(jīng)功能的影響,為探索抑制SAH炎癥的破壞作用開拓新思路和提供必要的理論依據(jù)。
研究方法:
根據(jù)不同的實驗內(nèi)容,該部分研究分四部分:
(1)建立大鼠SAH血管內(nèi)穿刺模型,觀察SAH后72h內(nèi)P2X7R/cryopyr
10、in炎癥小體通路隨時間的變化趨勢及其是否在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。應(yīng)用Western Blot方法檢測P2X7R,cryopyrin分子及其下游主要的炎癥因子IL-1β在SAH后2h,6h,24h,48h和72h的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察P2X7R和cryopyrin炎癥小體分別與小膠質(zhì)細(xì)胞共定位的情況。
(2)該部分實驗分為sham,SAH+Vehicle(生理鹽水,腦室注射),SAH+scramble smallinter
11、fering RNA(siRNA),SAH+P2X7R siRNA和SAH+cryopyrin siRNA。 SAH建模前24h,左側(cè)腦室注射P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA基因敲除相應(yīng)分子。采用改良Garcia評分綜合平衡木試驗評估大鼠SAH的神經(jīng)功能,干濕重法測量腦水腫及WesternBlot檢測相應(yīng)的下游分子水平,包括:P2X7R,cryopyrin,活化caspase-1,成熟的IL-1β和成熟的IL-18
12、。
(3)該實驗分為Naive,Naive+Lipopolysaccharide(LPS),Naive+LPS+Benzoyl benzoylATP(BzATP),Naive+LPS+BzATP+scramble siRNA,和Na(i)ve+LPS+BzATP+cryopyrinsiRNA。側(cè)腦室注射內(nèi)毒素LPS建立大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型。在該模型上,LPS注射前21h腦室注射scramble siRNA或cryopyr
13、in siRNA,LPS注射后3h腦室注射P2X7R的激動劑BzATP。 Western Blot檢測cryopyrin,活化caspase-1,成熟的IL-1β的表達(dá),確定大鼠腦內(nèi)P2X7R和cryopyrin炎癥小體之間的關(guān)系。
(4)該研究內(nèi)容分為sham,SAH+vehicle,SAH+brilliant blue G(BBG,5mg/kg),SAH+BBG(30mg/kg),SAH+BBG(100mg/kg)五組,選
14、取SAH后24h和72h作為觀察的時間點,采用改良的Garcia評分和平衡試驗評估大鼠SAH的行為學(xué),干濕重法測量腦水腫,Western Blot檢測相應(yīng)的下游分子水平改變,包括P2X7R,活化的caspase-1,成熟的IL-1β/IL-18和myeloperoxidase(MPO),免疫熒光技術(shù)檢測MPO以觀察SAH后中性粒細(xì)胞的浸潤情況。
研究結(jié)果:
(1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后72h內(nèi),cryopyrin和成熟
15、的IL-1β的表達(dá)在24h時達(dá)到高峰,而P2X7R的水平并沒有明顯的改變。Cryopyrin和P2X7R分別小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物為離子鈣接頭分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)共熒光定位,提示上述分子在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
(2)在SAH后24h,相比vehicle和scramble siRNA,P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA降低下游炎癥分子
16、活化caspase-1,成熟IL-1β及IL-18的表達(dá);緩解SAH后腦水腫和改善的大鼠的神經(jīng)功能評分。
(3)在LPS誘導(dǎo)的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥模型中,P2X7R的激動劑BzATP明顯增加下游炎癥因子:活化caspase-1和成熟IL-1β的水平。Cryopyrin siRNA能夠消除BzATP的促炎癥作用。
(4)中劑量BBG(30mg/kg)緩解SAH后的腦水腫,改善神經(jīng)功能評分,這種神經(jīng)功能保護(hù)作用可能與減少
17、炎癥因子:激活的caspase-1,成熟IL-1β/IL-18的表達(dá)有關(guān)。此外,BBG阻滯中性粒細(xì)胞向腦組織的浸潤。
研究結(jié)論:
SAH后,P2X7受體/cryopyrin炎癥小體信號通路激活caspase-1/IL-1β/IL-18,導(dǎo)致EBI中炎癥發(fā)生,該通路是調(diào)控SAH炎癥反應(yīng)發(fā)生的新機制,針對P2X7R/cryopyrin炎癥小體信號通路為此后的SAH的治療開拓新思路和提供必要理論依據(jù)。
2.P2X
18、7R阻斷劑抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血早期神經(jīng)元凋亡的機制研究
研究目的:
本課題試圖闡明大鼠SAH后P2X7R在神經(jīng)元凋亡中的作用,并探索該作用的具體信號機制,探索P2X7R/P38絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路在SAH后神經(jīng)元凋亡中的作用,從而進(jìn)一步闡明凋亡在SAH后EBI中的影響,并為探索抑制SAH后神經(jīng)元凋亡開拓新的研究思路。
研究方
19、法:
根據(jù)不同的實驗內(nèi)容,該部分研究分兩部分:
(1)該實驗分為sham,SAH+Vehicle,SAH+BBG和SAH+BBG+BzATP。SAH建模成功后30 min,于腹腔給予BBG或相應(yīng)等體積的Vehicle(生理鹽水)。P2X7R的激動劑BzATP于SAH建模前3h腦室注射。采用改良的Garcia評分和平衡木試驗分別評估SAH大鼠的行為學(xué);干濕重法測量腦水腫及Western Blot檢測相應(yīng)的下游分子水平改
20、變,包括:P2X7R,磷酸化P38 MAPK蛋白,Bcl-2及成熟caspase-3蛋白。免疫熒光雙染共定位P2X7R和神經(jīng)元細(xì)胞核(neuronal nuclei,NeuN)用來檢測該受體在神經(jīng)元上的表達(dá)分布情況。Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine5'-triphosphate-biotinnick end-labeling(TUNEL)染色觀察SAH后神經(jīng)元凋
21、亡情況。
(2)該實驗分為sham,SAH+Vehicle,SAH+scramble siRNA和SAH+P2X7R siRNA。SAH建模前24h,通過腦室注射P2X7R siRNA敲除相應(yīng)P2X7R,采用改良的Garcia評分和平衡木試驗分別評估SAH大鼠的行為學(xué),Western Blot檢測相應(yīng)的下游分子水平改變,包括P2X7R,磷酸化P38 MAPK蛋白及成熟caspase-3蛋白。
研究結(jié)果:
(
22、1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后24h,P2X7R在神經(jīng)元的細(xì)胞膜上表達(dá)。
(2) Western blot顯示30mg/kgBBG明顯減少SAH后24h P38 MAPK磷酸化水平的表達(dá),降低成熟caspase-3的表達(dá)水平,相反,增加抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)。TUNEL染色顯示BBG明顯減少SAH造成的神經(jīng)元凋亡。
(3)相比vehicle和scramble siRNA,P2X7R siRNA明顯減少SAH后24h磷酸
23、化P38MAPK的表達(dá),降低成熟caspase-3的表達(dá)水平,改善SAH后的神經(jīng)功能。
研究結(jié)論:
P2X7R參與SAH后EBI中神經(jīng)元凋亡。P2X7R抑制劑降低SAH后磷酸化P38MAPK的表達(dá),減少成熟caspase-3的表達(dá),最終,緩解神經(jīng)元凋亡并改善大鼠神經(jīng)功能。該研究闡明了P2X7R作為EBI中凋亡的新機制,為后續(xù)的SAH的抗凋亡治療開拓新思路和提供必要理論依據(jù)。
3.P2X7R阻斷劑抑制蛛網(wǎng)膜下
24、腔出血后神經(jīng)源性肺損傷的機制研究
研究目的:
本部分研究試圖闡明大鼠SAH后P2X7R在SAH后NPE中的作用,該受體阻斷劑能否通過其抗炎作用緩解NPE的癥狀,從而進(jìn)一步闡明炎癥在SAH后NPE中的作用,并為探索治療SAH引起的NPE開拓新的研究思路。
研究方法:
該實驗分為sham,SAH+Vehicle,SAH+BBG。SAH建模成功后30 min,于腹腔給予BBG(30mg/kg)或相應(yīng)等體
25、積的Vehicle(生理鹽水)。觀察NPE相關(guān)癥狀的發(fā)生率,測量大鼠的體重及肺濕重,Western Blot檢測肺葉中相應(yīng)的炎癥分子:成熟IL-1β和MPO的改變和緊密連接蛋白:zonula occludens-1(ZO-1)和occludin。明膠酶譜檢測肺組織內(nèi)matrix metaltopeptidase-9(MMP-9)的活性。P2X7R和I型肺泡上皮細(xì)胞(T1-α)進(jìn)行免疫熒光雙染。Hemotoxylin-eosin(HE)染
26、色比較上述三組肺損傷的情況。
研究結(jié)果:
(1)本組研究發(fā)現(xiàn)SAH后24h,P2X7R在I型肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。
(2)大鼠SAH后NPE相關(guān)癥狀的發(fā)生率與P指數(shù)相一致。
(3) BBG減少SAH后24h肺葉組織中成熟IL-1β和MPO的水平,抑制MMP-9的活化,增加緊密連接蛋白ZO-1和occludin的水平。HE染色顯示BBG明顯緩解SAH后肺組織損傷程度。
研究結(jié)論:
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