小麥TaMIR1139、TaMIR167及其靶基因和TaMIR1136的分子特征及抵御低磷逆境功能研究.pdf

1、小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小RNA分子，在植物體內(nèi)通過與靶基因序列互補對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平的調(diào)節(jié)，參與植物生長發(fā)育及其對生物和非生物逆境的響應(yīng)。本研究采用在線分析工具psRNARarget，對TaMIR1139可能作用的靶基因進行預(yù)測。以磷高效小麥品種石新828為材料，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，揭示了預(yù)測得到的靶基因的分子特征及應(yīng)答低磷逆境表達圖譜，并采用DNA重組和基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建對低磷有明顯應(yīng)答

2、靶基因的反義表達轉(zhuǎn)基因煙草植株。利用數(shù)字基因表達譜測序(DGE)技術(shù)對應(yīng)答低磷的TaMIR113和TaMIR167進行了轉(zhuǎn)錄譜的研究。對從前期構(gòu)建的富集豐磷特異表達基因的cDNA差減抑制雜交文庫中獲得的對低磷有明顯應(yīng)答的TaMIR167的靶基因TaARF6進行了正常和低磷逆境下植株生長調(diào)控效應(yīng)的研究。此外從miRBase數(shù)據(jù)庫中獲得對低磷有明顯應(yīng)答的TaMIR1136的序列信息，建立其轉(zhuǎn)基因煙草植株。主要研究結(jié)果如下:
　　1.預(yù)

3、測到TaMIR1139有九個作用靶基因，分別為TaMIR1139 T1(TC449025),TaMIR1139 T2 GLYCINE(CJ636238),TaMIR1139 T3 SCAFFO(TC384616),TaMIR1139 T4(TC397135),TaMIR1139 T5 R1BO(TC400227),TaMIR1139 T6 PEROXI(CB412183),TaMIR1139 T7 MYB1(TC397585),TaMI

4、R1139 T8(TC382427)及TaMIR1139 T9(CD930311)，表達分析表明，TaMIR1139 T1，T3，T4和T5均呈現(xiàn)明顯下調(diào)表達，且隨處理時間延長下調(diào)幅度逐漸加強，說明這些靶基因是誘導(dǎo)型表達，而其余屬翻譯水平調(diào)節(jié)是組成型表達。
　　2.以典型上調(diào)表達TaMIR1139的轉(zhuǎn)基因煙草T2代株系和野生型（對照，CK）植株為材料，進行了TaMIR1139介導(dǎo)植株抵御低磷逆境能力、轉(zhuǎn)錄譜及細胞保護酶相關(guān)基因表達

5、的研究。結(jié)果表明，在低磷逆境下，與CK相比，轉(zhuǎn)基因植株生長健壯，單株鮮干重顯著增加，保護酶（SOD、CAT和POD）活性上升，丙二醛(MDA)含量下降;轉(zhuǎn)錄譜的分析顯示，轉(zhuǎn)基因煙草中對低磷有明顯應(yīng)答的基因有3205個，其中，上調(diào)表達的有1683個，下調(diào)表達的有1522個，說明植株在低磷逆境下能迅速做出相應(yīng)調(diào)整使其適應(yīng)外界變化;細胞保護酶相關(guān)基因的上調(diào)表達，更進一步驗證了TaMIR1139在介導(dǎo)植株抵御低磷逆境的過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功

6、能。
　　3.以反義表達TaMIR167的轉(zhuǎn)基因煙草T2代株系和野生型(CK)植株為材料，進行了TaMIR167介導(dǎo)植株抵御低磷逆境能力、轉(zhuǎn)錄譜及細胞保護酶相關(guān)基因表達的研究。結(jié)果表明，在低磷逆境下，與CK相比，轉(zhuǎn)基因植株生長弱小，單株鮮干重顯著減少，SOD、CAT和POD活性下降，MDA含量上升，說明融合有反義表達TaMIR167的轉(zhuǎn)基因植株抵御低磷逆境能力下降;轉(zhuǎn)錄譜的分析顯示，轉(zhuǎn)基因煙草中對低磷有明顯應(yīng)答的基因有3540個，

7、其中，上調(diào)表達的有1745個，下調(diào)表達的有1795個。從細胞保護酶相關(guān)基因的下調(diào)表達上，進一步表明反義表達基因?qū)χ仓甑恼ＩL有很大影響。
　　4.利用前期獲得的富集豐磷特異表達基因的cDNA差減抑制雜交文庫查找 TaMIR167的靶基因TaARF6的序列信息，其cDNA序列全長為3655 bp，開放閱讀框長為2328 bp，編碼775個氨基酸(aa)。在低磷逆境下的表達特征研究表明，TaARF6在低磷條件下呈下調(diào)表達。采用DNA

8、重組技術(shù)構(gòu)建其正義表達載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　　5.以收獲的融合有TaARF6基因的轉(zhuǎn)基因煙草T2代和野生型(CK)植株為材料，對TaARF6基因介導(dǎo)植株應(yīng)答外界磷素供應(yīng)的特征進行了研究。結(jié)果表明，與CK相比，低磷處理后，在形態(tài)學(xué)上個體明顯增大，根系變長，鮮干物重均顯著增加;轉(zhuǎn)基因植株中細胞保護酶活性均較高，MDA的含量較低，結(jié)合保護酶相關(guān)基因的上調(diào)表達，說明TaARF6在介導(dǎo)植株抵御低磷逆境的過程中發(fā)揮著重要的

9、生物學(xué)功能。
　　6.從miRBase數(shù)據(jù)庫(Release10.1，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)中查找對低磷呈上調(diào)表達的Ta MIR1136的序列信息，其cDNA全長為107 bp，成熟序列為5'-uugucgcagguauggauguaucua-3'，預(yù)測其可能作用靶基因有14個，它們在生物學(xué)功能上大多起到轉(zhuǎn)導(dǎo)信號、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和運輸物質(zhì)等作用。采用RT-P