東北紅豆杉與美麗鐮刀菌的固定化法共生培養(yǎng).pdf

1、紫杉醇是一種二萜類衍生化合物，最早從紅豆杉屬植物中分離出來。由于其抗癌機制獨特，對多種惡性腫瘤療效突出，一直備受人們的關(guān)注。近年來國內(nèi)外利用紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)法和植物內(nèi)共生真菌發(fā)酵法產(chǎn)生紫杉醇成為研究熱點，但實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵問題難以突破，產(chǎn)量性狀不能滿足生產(chǎn)要求。內(nèi)共生真菌長期與宿主協(xié)同進化并形成了互惠互利的共生關(guān)系，相關(guān)研究顯示內(nèi)共生菌能夠參與植物活性成分的合成或者轉(zhuǎn)化；紅豆杉內(nèi)共生真菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)物能限制植物細(xì)胞生長，促進紫杉醇合成與

2、分泌；植物產(chǎn)生的誘導(dǎo)物也可促進內(nèi)共生真菌的紫杉醇合成與分泌。因此，模擬內(nèi)共生真菌與宿主植物的共生環(huán)境可能有助于研究兩者的關(guān)系、次生代謝產(chǎn)物的合成機制等。但內(nèi)共生真菌與紅豆杉植物細(xì)胞的離體培養(yǎng)無論是從環(huán)境條件(pH、溶氧、剪切力、培養(yǎng)基成分等)，還是生長代謝(生理狀態(tài)、生長周期、代謝產(chǎn)物、代謝途徑等)都存在巨大差異。本論文采用固定化培養(yǎng)法模擬東北紅豆杉(Taxus cuspidate)和美麗鐮刀菌(Fusarium mairei)的共生環(huán)

3、境，在保持兩類細(xì)胞生命活力的條件下對其相互作用進行初步研究，以期提高各自紫杉醇產(chǎn)量。主要研究方法和結(jié)果如下： 1.固定化細(xì)胞選擇和培養(yǎng)的探索：探索了F. mairei的三種海藻酸鈣固定化法和兩種聚乙烯醇固定化法；T. cuspidate細(xì)胞的海藻酸鈣固定化法，通過比較T. cuspidate與F. mairei的固定化培養(yǎng)狀況，選擇一種細(xì)胞和一種方法進行固定化培養(yǎng)。并詳細(xì)地研究了固定化條件包括培養(yǎng)基選擇、海藻酸鈉溶液濃度、CaCl2溶液

4、濃度、細(xì)胞包埋密度、凝膠珠直徑等多種因素對固定化細(xì)胞的活力與紫杉醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn). mairei的固定化操作不具有實用性。T. cuspidate細(xì)胞采用最溫和的海藻酸鈣固定化法，海藻酸鈉濃度在20 g/L時，T. cuspidate細(xì)胞包埋量在0.15～0.2 g/mL之間時，凝膠直徑在3～4 mm時，細(xì)胞細(xì)胞生長較穩(wěn)定，耗糖較快，酚類產(chǎn)量較低，且包埋的細(xì)胞沒有滲漏。 2.共生培養(yǎng)體系的優(yōu)化：詳細(xì)地研究了T. cuspida

5、te與F. mairei的接種量、接種時間、培養(yǎng)時間等多種因素對共生培養(yǎng)體系的影響。并進行對照實驗，排除植物細(xì)胞內(nèi)紫杉醇?xì)埩簟⑺兰?xì)胞分泌物或者滲漏的細(xì)胞碎片、固定化實驗材料等因素對實驗結(jié)果的干擾。通過正交實驗優(yōu)化共培養(yǎng)體系的最佳實驗條件為：海藻酸鈉濃度2％(M/V)，T. cuspidate細(xì)胞包埋量0.15 g/mL，CaCl2濃度4％(M/V)，凝膠直徑為3～3.5 mm，鈣化0.5 h，以40 mL接種量接入裝液量均為70 mL/

6、250 mL的共生培養(yǎng)基。25℃、黑暗、160 r/min震蕩培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)第9天接入10％(V/V)對數(shù)期的F. mairei培養(yǎng)物，繼續(xù)培養(yǎng)10天后收獲。結(jié)果表明，F(xiàn). mairei對T. cuspidate細(xì)胞的生長有強烈抑制作用，能誘導(dǎo)紫杉醇等次生代謝物向胞外分泌；T. cuspidate細(xì)胞的分泌物對F. mairei的紫杉醇產(chǎn)量也有顯著影響。 3.選擇合適的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，以期提高紫杉醇的產(chǎn)量。詳細(xì)地研究了培養(yǎng)基成分(

7、改良MS培養(yǎng)基主要營養(yǎng)元素、促細(xì)胞活力添加劑、促紫杉醇產(chǎn)量添加劑等、促產(chǎn)物釋放添加劑等)對共培養(yǎng)體系中的傳質(zhì)效果、F. mairei的紫杉醇生產(chǎn)和菌體增殖、固定化T. cuspidate的細(xì)胞活力等的影響，以及搖瓶裝液量、補加碳源對終產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中CA含量的升高有利于F. mairei菌體的增殖，鑒于紫杉醇積累和細(xì)胞生長之間的矛盾，二者最佳平衡點即MS培養(yǎng)基原有添加量；細(xì)胞生長素2,4-D、NAA和細(xì)胞分裂素6-BA對F

8、. mairei的紫杉醇生產(chǎn)和菌體增殖幾乎沒有影響，細(xì)胞分裂素KT的濃度升高時對F. mairei的紫杉醇產(chǎn)量有抑制作用；在F.mairei培養(yǎng)第6天補加30 g/L蔗糖可以促進紫杉醇產(chǎn)量提高和代謝物釋放。裝液量的差異導(dǎo)致的溶氧差異也能顯著影響紫杉醇產(chǎn)量。本實驗改良MS培養(yǎng)基，提高原有礦物質(zhì)元素KH2PO4、CaCl2、(NH4)2SO4、FeSO4-Na2·EDTA濃度均不利于F. mairei的紫杉醇生產(chǎn)；提高CaCl2、(NH4)

9、2SO4、FeSO4-Na2·EDTA濃度對F. mairei的菌體增殖還有抑制作用，可能是pH偏酸性引起菌體代謝合成途徑不同。不同濃度的H3BO3對F. mairei的紫杉醇生產(chǎn)和菌體增殖幾乎沒有影響，推測F. mairei采用PVA-H3BO3固定化法培養(yǎng)時細(xì)胞生長受到抑制的主要影響因素是PVA、固定化操作環(huán)節(jié)或是酸性pH?；瘜W(xué)釋放劑對F. mairei的紫杉醇生產(chǎn)和菌體增殖、對T. cuspidate細(xì)胞固定化培養(yǎng)中紫杉醇釋放率的