球孢白僵菌甘露糖轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、叉頭轉(zhuǎn)錄因子及6-磷酸海藻糖合成酶的功能解析及其同生物防治潛能的關(guān)聯(lián).pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是廣泛用于農(nóng)林害蟲生物防治的昆蟲病原真菌，其侵染體是分生孢子，也是許多真菌殺蟲劑的活性成分。分生孢子制劑防治田間害蟲的效果往往受到溫度、濕度、紫外輻射及化學(xué)農(nóng)藥等多種環(huán)境脅迫的影響。因此，探索生防真菌抗逆境脅迫的生理機(jī)制，對(duì)以提高其生防潛能為目標(biāo)的菌株遺傳改良及菌劑的合理應(yīng)用具有重要意義。本研究圍繞這一目標(biāo)，一是解析了球孢白僵菌甘露糖轉(zhuǎn)移酶PMT和Ktr家族的功能，揭示了它們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)

2、育、環(huán)境抗逆性及寄主侵染力的重要貢獻(xiàn)。二是研究解析了乙酰轉(zhuǎn)移酶Mst2對(duì)球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答、細(xì)胞周期和毒力的影響。三是解析forkhead轉(zhuǎn)錄因子Fkh2的功能，發(fā)現(xiàn)Fkh2通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而參與球孢白僵菌細(xì)胞周期、無(wú)性發(fā)育及毒力的調(diào)控。四是解析了球孢白僵菌中兩個(gè)海藻糖合成酶同源蛋白TpsA和TpsB對(duì)海藻糖合成、生長(zhǎng)發(fā)育、孢子質(zhì)量、多脅迫響應(yīng)及毒力的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)幾乎所有生防潛能相關(guān)性狀的貢獻(xiàn)都表現(xiàn)為加性效應(yīng)。主要的

3、研究?jī)?nèi)容和結(jié)果概述如下:
　　球孢白僵菌PMT家族甘露糖轉(zhuǎn)移酶的功能解析PMT家族是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上催化第一個(gè)甘露糖轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸上的一類甘露糖轉(zhuǎn)移酶，根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為PMT1、PMT2和PMT4三個(gè)亞族。這三個(gè)亞族都存在于球孢白僵菌中且每個(gè)亞族只有一個(gè)成員，分別為Pmt1、Pmt2和Pmt4。其中Pmt2是敲除致死的，通過(guò)構(gòu)建Pmt2的RNA干擾菌株和Pmt1及Pmt4的單基因敲除/回補(bǔ)菌株并進(jìn)行多種表型分析，三個(gè)基因的

4、功能得到較為詳盡的解析。與野生型相比，單基因缺失或RNA干擾菌株在生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子活力、多脅迫耐受力及毒力等諸方面均表現(xiàn)不同程度的缺陷。其中，Pmt2的三個(gè)干擾菌株、ΔPmt1及ΔPmt4在富營(yíng)養(yǎng)和限制培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)減慢20～79％，分生孢子產(chǎn)量下降16～72％，并伴隨孢子活力顯著下降即萌發(fā)一半所需的時(shí)間顯著延長(zhǎng)。不僅如此，干擾及敲除菌株在菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)期間，對(duì)氧化、高滲、胞壁干擾、高溫及UV-B輻射等環(huán)境脅迫的抵抗力都有不同程度的

5、顯著下降。在對(duì)大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲的生物測(cè)定中，突變株經(jīng)正常體壁侵染的毒力下降53～62％，但通過(guò)血腔注射的毒力未發(fā)生大的變化。值得一提的是，突變株的孢壁完整性遭受很大程度的破壞，包括孢壁變薄、孢子表面疏水性降低及重要孢壁成分發(fā)生改變。所有表型的變化都在回補(bǔ)株中得到恢復(fù)。因此，PMT家族在球孢白僵菌中都不是功能冗余的，而是各成員相互協(xié)調(diào)共同調(diào)節(jié)宿主菌對(duì)復(fù)雜多樣環(huán)境的適應(yīng)性及對(duì)昆蟲寄主的侵染力，因而在球孢白

6、僵菌生防潛能的維持中發(fā)揮著互不替代的重要作用。
　　球孢白僵菌Ktr家族甘露糖轉(zhuǎn)移酶的功能比較Ktr家族甘露糖轉(zhuǎn)移酶的功能是將第二個(gè)甘露糖連接到被PMT家族成員轉(zhuǎn)移的第一個(gè)甘露糖基上，因而是對(duì)糖蛋白甘露糖鏈進(jìn)行延伸的轉(zhuǎn)移酶，其調(diào)控的反應(yīng)發(fā)生在高爾基體內(nèi)。球孢白僵菌有三個(gè)Ktr家族成員，分別為Ktr1、Ktr4和Kre2/Mnt1。通過(guò)單基因敲除/回補(bǔ)菌株的構(gòu)建并進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)Δktr4和Δkre2的分生孢子產(chǎn)量大幅下降～92％

7、，孢子活力顯著降低，孢子大小和復(fù)雜度也發(fā)生顯著變化;兩個(gè)敲除菌株對(duì)培養(yǎng)基中不同碳、氮源營(yíng)養(yǎng)的攝入利用率不如野生株，表現(xiàn)為菌落生長(zhǎng)緩慢。與野生型相比，Δktr1在孢子產(chǎn)量及菌落生長(zhǎng)方面并無(wú)顯著變化，但細(xì)胞壁中甘露糖蛋白和幾丁質(zhì)等成分的變化都遠(yuǎn)大于Δktr4和Δkre2，菌絲細(xì)胞壁變薄，孢子細(xì)胞壁表面疏水性下降12％。Δktr4和Δkre2細(xì)胞壁中α-葡聚糖含量顯著高于野生型和Δktr1，孢子壁厚度也比Δktr1更薄，孢子表面疏水性分別下降

8、64％和71％?？傮w上，Δktr4和Δkre2比Δktr1對(duì)氧化和胞壁干擾脅迫更敏感，但三者對(duì)高滲脅迫的反應(yīng)則差異不大。高溫、UV-B輻射耐受性以及毒力在Δktr4和Δkre2中都大大下降，而Δktr1只對(duì)高溫敏感。結(jié)果顯示，Ktr1、Ktr4和Kre2對(duì)球孢白僵菌生防潛能都有不同程度的貢獻(xiàn)，但Ktr4和Kre2的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于Ktr1的貢獻(xiàn)。
　　球孢白僵菌組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mst2的功能解析組蛋白中賴氨酸的乙?；c基因的轉(zhuǎn)錄活性密切

9、相關(guān)，但由于多數(shù)乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)賴氨酸的特異性修飾作用知之有限，每個(gè)賴氨酸乙?；c細(xì)胞功能之間的關(guān)系目前并不十分清楚。球孢白僵菌中有一個(gè)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mst2，它與裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)乙酰轉(zhuǎn)移酶SpMst2同源，并能特異性乙?；M蛋白3(H3)的第14位賴氨酸(H3K14)。為了明確Mst2在球孢白僵菌中的作用，我們構(gòu)建和分析了Mst2的敲除/回補(bǔ)菌株。表型實(shí)驗(yàn)顯示，ΔMst2對(duì)不同

10、碳氮源的利用能力遠(yuǎn)不如野生株和回補(bǔ)株，正常培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢能力受損較大，孢子活力下降，抵抗氧化、高滲及胞壁干擾脅迫的能力顯著下降。敲除株分生孢子耐高溫、抗紫外能力顯著減弱，表面疏水性和對(duì)敏感昆蟲的侵染力均下降。細(xì)胞流式分析顯示，ΔMst2的芽生孢子變小，密度降低，細(xì)胞周期中S期延長(zhǎng)，G2/M期縮短。綜合所有分析結(jié)果，Mst2在DNA損傷節(jié)點(diǎn)上起著關(guān)鍵作用，因而參與調(diào)控球孢白僵菌的細(xì)胞周期、無(wú)性發(fā)育、多脅迫應(yīng)答及其對(duì)昆蟲寄主的侵染力。

11、r>　　球孢白僵菌叉頭轉(zhuǎn)錄因子Fkh2的功能解析模式絲狀真菌一般擁有叉頭Forkhead(FKH)轉(zhuǎn)錄因子Fkh1和Fkh2，主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控而影響生物學(xué)性狀。不同于模式絲狀真菌，球孢白僵菌只有Fkh2，不存在Fkh1。將Fkh2編碼基因從野生株中敲除，導(dǎo)致球孢白僵菌細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，在不同碳氮源培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)不同程度地減慢，而且敲除菌株的菌絲隔膜增多，菌絲細(xì)胞粗短。有趣的是，敲除株的產(chǎn)孢提前，在正常平板培養(yǎng)條件下分生孢子產(chǎn)量

12、顯著升高，在液培條件下芽生孢子的產(chǎn)量也顯著高于野生株，但兩種孢子都明顯變小，且密度降低，顯示孢子內(nèi)含物減少。其分生孢子對(duì)氧化和高滲脅迫的敏感性升高，耐UV-B輻射和高溫的能力減弱，說(shuō)明Fkh2可能參與宿主菌的脅迫應(yīng)答。此外，用分生孢子懸液對(duì)大蠟螟幼蟲進(jìn)行體壁侵染和注射侵染的生物測(cè)定，結(jié)果顯示敲除菌株的毒力顯著降低。敲除菌株所有這些表型變化都在若干表型相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄分析中獲得支持，并且都在回補(bǔ)菌株中得到很好的恢復(fù)。結(jié)果顯示，F(xiàn)kh2不

13、僅參與調(diào)控球孢白僵菌的細(xì)胞周期循環(huán)，而且還調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、多脅迫應(yīng)答及毒力等多種生防潛能相關(guān)的性狀。
　　球孢白僵菌中兩種6-磷酸海藻糖合成酶同源物的功能解析海藻糖的生物合成途徑對(duì)于動(dòng)植物病原真菌是非常重要的，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)海藻糖的積累水平關(guān)系到宿主菌的環(huán)境適應(yīng)性和寄主侵染力。球孢白僵菌有兩個(gè)6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)，分別為TpsA和TpsB。通過(guò)單基因、雙基因敲除菌株及回補(bǔ)菌株的構(gòu)建與分析，發(fā)現(xiàn)雙敲菌株ΔtpsAΔtpsB的菌絲

14、細(xì)胞中既檢測(cè)不到TPS的酶活，也檢測(cè)不到任何海藻糖的積累;而單敲菌株ΔtpsA的TPS酶活和海藻糖積累水平在正常和同脅迫條件下分別下降71～75％和72～80％，在ΔtpsB中分別下降21～30％和15～45％。兩個(gè)單敲株在給定條件下TPS酶活損失或海藻糖積累水平下降幅度之和，正好接近雙敲菌株的酶活損失或海藻糖含量的下降幅度。正常培養(yǎng)條件下分生孢子產(chǎn)量在雙敲株中下降達(dá)98％，而在ΔtpsA和ΔtpsB中分別下移33％和50％。有趣的是，

15、表征孢子質(zhì)量的海藻糖含量、孢壁結(jié)構(gòu)成分、疏水性、活力、大小及密度均在雙敲株中受損最嚴(yán)重，后依次為ΔtpsA和ΔtpsB。相同的趨勢(shì)也見于三個(gè)敲除株對(duì)氧化、高滲、胞壁干擾、高溫及UV-B紫外輻射等環(huán)境脅迫抵抗力的缺陷變化以及對(duì)大蠟螟幼蟲毒力的缺陷變化。這些結(jié)果證明，球孢白僵菌中TpsA對(duì)海藻糖合成、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、孢子質(zhì)量、多脅迫應(yīng)答及寄主侵染過(guò)程的調(diào)控作用均大于TpsB，后者僅表現(xiàn)比前者稍強(qiáng)的產(chǎn)孢調(diào)控作用。最重要的是，TpsA和TpsB對(duì)球孢