烏頭湯抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用及機(jī)制探索.pdf

1、目的：
　　在中醫(yī)辨證論治思想指導(dǎo)下，采用與臨床特征相近的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)疾病模型和經(jīng)改良的RA病證結(jié)合模型，對(duì)寒痹經(jīng)典名方烏頭湯的抗RA藥效作用進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，并探討相關(guān)機(jī)制，為烏頭湯的臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為同類(lèi)中藥復(fù)方的研究提供方法學(xué)參考。
　　方法：
　　1.RA模型的建立：
　　1)RA單純疾病模型：選用健康雄性SD大鼠，采用Ⅱ膠原(CⅡ)乳化劑于第0和7天尾根皮下散點(diǎn)注射二次誘導(dǎo)，建立CIA

2、模型；
　　2)RA病證結(jié)合模型：參考文獻(xiàn)并經(jīng)改良建立RA風(fēng)寒濕證(又稱(chēng)CIA寒證)和風(fēng)濕熱證(又稱(chēng)CIA熱證)模型。在復(fù)制CIA模型的同時(shí)，模擬類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎致病原因，分別施加外界風(fēng)寒濕(風(fēng)速6 m/s，相對(duì)濕度均為60％，溫度為6℃，連續(xù)15天)、風(fēng)濕熱(風(fēng)速6 m/s，相對(duì)濕度均為95％，溫度為37℃，連續(xù)9天)條件刺激，造成CIA寒證和CIA熱證模型。
　　2.動(dòng)物分組、給藥和取材：雄性SD大鼠224只，共設(shè)21天、

3、35天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)114只，每組16只(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只)，隨機(jī)分為14組，組別如下：正常組，膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)組，CIA加烏頭湯高、中、低治療組，CIA寒組，CIA寒加烏頭湯高、中、低治療組，CIA熱組，CIA熱加烏頭湯高、中、低治療組，CIA加甲氨喋呤治療組。烏頭湯1.88，3.75，7.5g/kg三個(gè)劑量(分別相當(dāng)于臨床0.5倍、1倍、2倍等效劑量)，甲氨喋呤0.2 mg/kg一個(gè)劑量(相當(dāng)于臨床1倍等效劑量)。從

4、免疫當(dāng)天開(kāi)始給藥，烏頭湯每給藥6天，間歇1天，甲氨蝶呤每給藥3天，間歇1天。21天和35天分別處死動(dòng)物，取血備用進(jìn)行血液流變學(xué)、免疫學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，取關(guān)節(jié)組織固定備用用于組織病理學(xué)和影像學(xué)檢測(cè)，取內(nèi)臟固定備用以進(jìn)行一般毒性檢查。
　　3.關(guān)節(jié)炎發(fā)病率和疾病嚴(yán)重度及寒、熱證證候指標(biāo)評(píng)價(jià)：肉眼觀察大鼠關(guān)節(jié)紅腫癥狀，參照Chery1 L方法進(jìn)行臨床積分，踝關(guān)節(jié)大于1分或者掌關(guān)節(jié)大于1分算發(fā)?。幻恐淮笫?只足，觀察并記錄發(fā)病足數(shù)，與總

5、足數(shù)之比即為肢體累計(jì)率；記錄每只大鼠起始發(fā)病時(shí)間；采用紅外熱像儀檢測(cè)關(guān)節(jié)表面溫度；熱板測(cè)痛儀檢測(cè)關(guān)節(jié)疼痛閩值；肉眼觀察關(guān)節(jié)紅腫程度；激光多普勒血流檢測(cè)儀檢測(cè)右后肢足背的微血流量；血液流變檢測(cè)儀檢測(cè)血液粘度；紅細(xì)胞壓積檢測(cè)儀檢測(cè)紅細(xì)胞壓積；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)大鼠血清抗CⅡ抗體IgG和IgM含量。
　　4.關(guān)節(jié)組織病理學(xué)與影像學(xué)改變?cè)u(píng)價(jià)：采用HE染色法鏡下觀察各組動(dòng)物膝、踝關(guān)節(jié)的病理變化；采用X線拍攝同一側(cè)踝關(guān)節(jié)，

6、觀察關(guān)節(jié)間隙、骨侵蝕及骨破壞情況并采用雙盲法進(jìn)行計(jì)分。
　　5.關(guān)節(jié)滑膜炎癥相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-17、TNFα、VEGF及炎癥介質(zhì)PGE2的表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)關(guān)節(jié)組織中炎癥介質(zhì)COX-1、COX-2表達(dá)水平，同時(shí)進(jìn)行圖像分析。
　　6.關(guān)節(jié)軟骨侵襲破壞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用番紅-O染色法鏡下觀察炎癥關(guān)節(jié)軟骨成分蛋白聚糖的表達(dá)情況并進(jìn)行圖像分析，評(píng)價(jià)軟骨破壞程度。免疫組織化學(xué)

7、法檢測(cè)炎癥關(guān)節(jié)軟骨中蛋白水解酶ADAMTS-4、基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs-1，3及其內(nèi)源性特異性抑制劑TIMPs-1，3的表達(dá)水平，同時(shí)進(jìn)行圖像分析。
　　7.一般毒性評(píng)估：采用電子稱(chēng)稱(chēng)取大鼠體重；觀察大鼠毛色狀況并記錄；稱(chēng)取大鼠新鮮肝臟、腎臟，計(jì)算相應(yīng)臟器指數(shù)；采用生化法檢測(cè)血清中BUN、CK、Cr、GOT、GPT、LDH的含量。
　　結(jié)果：
　　1.CIA和CIA寒、熱證模型的評(píng)價(jià)及疾病嚴(yán)重度評(píng)估
　　1)從反

8、映模型成功與否和疾病嚴(yán)重度指標(biāo)來(lái)看，復(fù)制的CIA模型大鼠臨床紅腫、畸形癥狀表現(xiàn)明顯，發(fā)病率87.5％，臨床積分最高23分，平均首次發(fā)病時(shí)間11.99天，肢體累計(jì)率45.78％；改良造模條件復(fù)制的CIA寒證、CIA熱證模型，發(fā)病率均為100％，最高臨床積分分別為31和28.875，首次發(fā)病時(shí)間分別為11.25和11.125天，肢體累計(jì)率分別為51.4％和53.75％；與CIA相比，風(fēng)寒濕條件刺激誘導(dǎo)的CIA寒證和風(fēng)濕熱條件刺激誘導(dǎo)的CIA

9、熱證模型的發(fā)病率和疾病嚴(yán)重度均升高。
　　2)從反映寒熱證候秤價(jià)指標(biāo)看，風(fēng)寒濕條件刺激能降低CIA大鼠關(guān)節(jié)表面溫度、提高關(guān)節(jié)疼痛閾值和升高低剪切率下的全血粘度和血漿粘度；風(fēng)濕熱條件刺激能升高CIA大鼠關(guān)節(jié)表面溫度、降低免疫3周后CIA大鼠的關(guān)節(jié)疼痛閾值和降低全血粘度和血漿粘度；風(fēng)寒濕和風(fēng)濕熱條件刺激對(duì)CIA大鼠紅細(xì)胞壓積的影響不明顯，但也分別有升高和降低的作用趨勢(shì)。
　　2.烏頭湯對(duì)CIA和CIA寒、熱證大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率和疾

10、病嚴(yán)重度的影響
　　1)烏頭湯可以降低CIA大鼠的發(fā)病率(最高降低27.5％)、臨床積分(最高降低12分)、肢體累計(jì)率(最高降低14.5％)和延長(zhǎng)首次發(fā)病時(shí)間(最高延長(zhǎng)0.72天)，降低血清抗CⅡ膠原抗體IgG(21天降低34％，34天降低33％)和IgM(21天降低30％，34天降低33％)的水平，其中1.88g/kg劑量組療效較好；烏頭湯可以降低CIA寒證大鼠的發(fā)病率(最高降低50％)、臨床積分(最高降低14分)、肢體累計(jì)率(

11、最高降低23.4％)和延長(zhǎng)首次發(fā)病時(shí)間(最高延長(zhǎng)2.58天)，降低血清抗CII膠原抗體IgG(21天降低34％，34天降低27％)和IgM(21天降低36％，34天降低29％)的水平，其中7.5g/kg劑量組療效較好：烏頭湯也有一定的降低CIA熱證大鼠發(fā)病率(最高降低12％)、臨床積分(最高降低6分)、肢體累計(jì)率(最高降低4％)的作用趨勢(shì)，延長(zhǎng)首次發(fā)病時(shí)間(最高延長(zhǎng)0.375天)的作用也很微弱，降低血清抗CⅡ膠原抗體IgG(21天降低3

12、4％，34天降低25％)和IgM(21天降低24％，34天降低23％)的水平。
　　2)烏頭湯可以降低CIA大鼠的關(guān)節(jié)表面溫度(21天降低0.77℃，34天降低1.34℃)、關(guān)節(jié)表面血流速度(21天降低12％)、低剪切率下的全血粘度(21天降低9％)和紅細(xì)胞壓積(21天最高降低1％)，提高疼痛閾值(21天提高0.84，34天提高1.05)，對(duì)血漿粘度沒(méi)有明顯作用，其中1.88 g/kg劑量組療效較好；烏頭湯可以降低CIA寒證大鼠的

13、關(guān)節(jié)表面溫度(21天降低1.42℃，34天降低1.53)℃、關(guān)節(jié)表面血流速度(21天降低16％)、低剪切率下的全血粘度(21天降低12％)和紅細(xì)胞壓積(21天最高降低1.92％)，提高疼痛閾值(21天提高1.33，34天提高1.39)，對(duì)血漿粘度沒(méi)有明顯作用，其中7.5 g/kg劑量組療效較好；烏頭湯對(duì)CIA熱證大鼠的關(guān)節(jié)表面溫度、關(guān)節(jié)表面血流速度、低剪切率下的全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積均沒(méi)有明顯作用，能提高疼痛閾值(21天提高0.

14、47，34天提高0.81)。
　　3.烏頭湯對(duì)不同RA模型大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)和影像學(xué)改變的影響
　　1)烏頭湯可以降低CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳形成，降低軟骨和骨破壞程度，降低關(guān)節(jié)骨侵蝕程度(降低20％)和骨破壞等級(jí)(降低19％)，對(duì)骨關(guān)節(jié)間隙改善不明顯，其中1.88 g/kg劑量組療效較好。
　　2)烏頭湯可以降低CIA寒證大鼠的關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳形成，降低軟骨和骨破壞程度，降低關(guān)

15、節(jié)骨侵蝕程度(降低46％)和骨破壞等級(jí)(降低34％)，對(duì)骨關(guān)節(jié)間隙改善不明顯，其中7.5 g/kg劑量組療效較好。
　　3)烏頭湯對(duì)CIA熱證大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)和影像學(xué)的改善作用不明顯。
　　4.烏頭湯對(duì)不同RA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥的影響
　　烏頭湯可以降低CIA大鼠血清中IL-1β(21天降低22.1％，34天降低32.5％)、IL-17(21天降低35.6％，34天降低19.8％)、TNFα(21天降低20.5％，

16、34天降低34.4％)、VEGF(21天降低33.3％，34天降低37.6％)和炎癥介質(zhì)PGE2(21天降低34.6％，34天降低30.02％)的含量，抑制炎癥關(guān)節(jié)PGE2的誘導(dǎo)型合成酶COX-2(21天降低25.5％)表達(dá)水平，對(duì)COX-1基本沒(méi)有影響。烏頭湯降低CIA寒證大鼠血清中IL-1β(21天降低41.7％，34天降低30.6％)、IL-17(21天降低32.3％，34天降低29.1％)、TNFα(21天降低26.7％，34天

17、降低28.8％)、VEGF(21天降低34.2％，34天降低27.2％)和炎癥介質(zhì)PGE2(21天降低31.2％，34天降低28.8％)的含量，抑制炎癥關(guān)節(jié)PGE2的誘導(dǎo)型合成酶COX-2(21天降低44.1％)的表達(dá)水平。烏頭湯對(duì)兩種模型的作用靶點(diǎn)相似，其中對(duì)CIA大鼠的療效以1.88～3.75 g/kg為主，對(duì)CIA寒證大鼠的療效以3.75～7.5 g/kg為主。
　　5.烏頭湯對(duì)不同RA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨侵襲的影響
　　

18、烏頭湯可以提高免疫21天CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖的含量(提供34.97％)，降低關(guān)節(jié)中ADAMTS-4(降低20.1％)和MMP-3(降低39.7％)的表達(dá)水平，同時(shí)升高TIMP-1(提高27.1％)和TIMP-3(提高48.1％)的表達(dá)水平，對(duì)MMP-1的抑制作用不明顯(降低3.4％)。烏頭湯可以提高免疫21天CIA寒證大鼠關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖的含量(提供113％)，降低免疫21天CIA大鼠關(guān)節(jié)中ADAMTS-4(降低.30.15％

19、)、MMP-1(降低40％)和MMP-3(降低48.2％)的表達(dá)水平，同時(shí)升高TIMP-1(提高28.3％)和TIMP-3(提高46.9％)的表達(dá)水平。
　　6.烏頭湯對(duì)不同RA模型大鼠一般毒性指標(biāo)的影響
　　烏頭湯對(duì)CIA大鼠、CIA寒證和CIA熱證大鼠的體重、毛色等一般狀況基本沒(méi)有影響，對(duì)大鼠肝臟、腎臟指數(shù)及病理變化亦無(wú)明顯影響，對(duì)大鼠血清中BUN、CK、Cr、GOT、GPT、LDH的含量有輕微影響，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示

20、烏頭湯發(fā)揮抗RA作用的同時(shí)沒(méi)有觀察到明顯的毒副作用。
　　結(jié)論：
　　本研究較成功復(fù)制了大鼠RA疾病模型(CIA)，同時(shí)探索建立了大鼠CIA寒、熱證模型。在中醫(yī)辨證論治思想指導(dǎo)下，對(duì)烏頭湯“對(duì)證”和“不對(duì)證”治療RA的作用進(jìn)行了比較研究，并闡述部分作用機(jī)制。相關(guān)研究結(jié)論如下：
　　1)烏頭湯對(duì)CIA和CIA寒證大鼠均具防治作用。其中，烏頭湯對(duì)CIA寒證的作用更強(qiáng)，且呈一定的量效關(guān)系(1.88 g/kg～7.5 g/kg

21、劑量范圍內(nèi))，反之，相同劑量對(duì)CIA熱證大鼠的防治作用不明顯。
　　2)烏頭湯能抑制血清中細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)的含量、炎癥關(guān)節(jié)軟骨中蛋白水解酶和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平，同時(shí)提高基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制劑的表達(dá)有關(guān)，這可能是其治療CIA和CIA寒證大鼠的作用機(jī)制之一。
　　3)烏頭湯對(duì)CIA和CIA寒證大鼠的作用靶點(diǎn)相似，相同劑量范圍內(nèi)對(duì)CIA寒證軟骨成分和蛋白酶的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于CIA，對(duì)CIA大鼠炎癥因子的效價(jià)優(yōu)于CIA寒證。<