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文檔簡(jiǎn)介
1、嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)的行為活動(dòng)中起著不可或缺的作用,如在尋找寄主、識(shí)別配偶、選擇產(chǎn)卵場(chǎng)所等方面都有著重要意義。氣味結(jié)合蛋白OBPs(含信息素結(jié)合蛋白PBPs)在嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程中運(yùn)輸氣味分子方面起著一定作用,但其具體功能仍不明確。如果能清楚昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)機(jī)制,將有助于害蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)和防治方面的研究。本課題以水稻重要害蟲(chóng)稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenée)為研究對(duì)象,在對(duì)其PBPs原核表達(dá)及重組PBPs純化的基礎(chǔ)上,通過(guò)免
2、疫化學(xué)細(xì)胞定位技術(shù)觀察并分析了PBPs在觸角感器中的準(zhǔn)確分布,利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合技術(shù)分析了重組PBPs與不同配基的結(jié)合特性及與pH值的相關(guān)性。主要取得的研究結(jié)果如下:
1、稻縱卷葉螟信CmedPBP4的原核表達(dá)與蛋白純化
依據(jù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),將之前PCR獲得全長(zhǎng)的CmedPBP4基因序列重新構(gòu)建原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)(GenBank登錄號(hào)為KC507185,其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為444bp,編碼147個(gè)氨基酸,
3、分子量16.4 kDa),利用包涵體變復(fù)性的方法將對(duì)存在于沉淀的重組蛋白進(jìn)行處理,獲得大量重組蛋白,利用DE52弱陰離子交換層析柱和Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化回收,用于制備多克隆抗體和熒光結(jié)合特性分析。
2、稻縱卷葉螟CmedPBP4在觸角感器的免疫定位
利用純化的CmedPBP4作為抗原,制備相應(yīng)的多克隆抗體,通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)抗體的特異性,條帶的分子量在16.
4、4kDa左右,說(shuō)明所得為CmedPBP4的抗體;另外通過(guò)與不同組織蛋白進(jìn)行Western Blot發(fā)現(xiàn),CmedPBP4抗體僅與稻縱卷葉螟雌雄成蟲(chóng)觸角組織蛋白有特異性反應(yīng),而且后者更明顯。
結(jié)合掃描電鏡和透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)CmedPBP4僅在有厚壁的毛形感器的淋巴液中有標(biāo)記即僅分布于毛形感器中,可能與感受性信息素有關(guān)。
3、稻縱卷葉螟CmedPBP4的結(jié)合特性分析
以1-NPN為探針,分別研究了在酸性和中性
5、緩沖液條件下CmedPBP4與41種不同配基(含4種性信息素物質(zhì)和37種水稻揮發(fā)物)的結(jié)合特性。結(jié)果表明,在酸性條件下,CmedPBP4與不同配基的結(jié)合特性要明顯低于中性條件;pH=7.4時(shí), CmedPBP4與3種性信息素物質(zhì)(Z13-18∶Ac,Z11-16∶Al和Z13-18∶OH)及水稻揮發(fā)物中的環(huán)己醇、橙花叔醇、柏木腦、月桂醛、紫羅蘭酮、(-)-α-雪松烯、(Z)-法尼烯、trans-石竹烯、R-(+)-檸檬烯、(-)-檸檬烯
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