納米磁粒靶向基因、磁感應(yīng)加熱、核素內(nèi)照射聯(lián)合治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 1、研究用于腫瘤磁流體熱療的錳鋅鐵氧體磁性納米粒子(Mn0.4Zn0.6Fe2O4,MNPs)的制備及其生物相容性；
　　 2、評(píng)價(jià)PEI修飾的納米級(jí)Mn0.4ZNn0.6Fe2O4磁性納米粒子(PEI/Mn0.4Zn0.6Fe2O4)作為基因載體的可行性及外加磁場(chǎng)對(duì)于其轉(zhuǎn)染效率的影響；
　　 3、構(gòu)建用于靶向基因治療的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pHSP-HSV-TK；
　　 4、觀察pHSP-HSV

2、-TK復(fù)合納米磁粒聯(lián)合磁感應(yīng)加熱及核素內(nèi)照射靶向治療兔VX2肝癌移植瘤的作用,探討其靶向治療肝癌的有效性和可行性。
　　 方法:
　　 1、采用改良的化學(xué)共沉淀法制備錳鋅鐵氧體磁性納米粒子。利用TEM、XRD、SEM-EDS、VSM、Perkin-Elmor7系列熱分析系統(tǒng)等手段對(duì)其形貌、物象、成份、磁性能及居里溫度等進(jìn)行表征。MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其體外細(xì)胞毒性;溶血試驗(yàn)評(píng)價(jià)其有無(wú)溶血作用；小鼠腹腔注射材料混懸液以測(cè)定其LD5

3、0；微核試驗(yàn)評(píng)價(jià)其有無(wú)致畸、致突變作用:兔肝臟穿刺注射Mn0.4Zn0.6Fe2O4納米粒后觀察形態(tài)學(xué)及血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)的改變。2、采用聚乙烯亞胺(PEI)錳鋅鐵氧體磁性納米粒子進(jìn)行表面修飾;透射電鏡(TEM)及掃描電鏡(SEM)觀察修飾前后磁性粒子形貌；傅立葉紅外光譜(FTIR)分析磁性粒子表面的官能團(tuán)變化；光電子能譜儀(XPS)進(jìn)行磁性粒子的表面成份分析；UV/vis光譜儀檢測(cè)修飾前后磁性粒子的懸浮穩(wěn)定性和磁響應(yīng)性；Zeta電

4、位儀檢測(cè)磁性粒子在不同pH值下的表面電位；采用Bradford法測(cè)定PEI在納米粒子上吸附量；紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同修飾條件下的磁性納米粒子的DNA結(jié)合保護(hù)、體外釋放能力及轉(zhuǎn)染能力；體內(nèi)外加熱實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其升溫恒溫能力；應(yīng)用報(bào)告基因,檢測(cè)PEI/Mn0.4Zn0.6Fe2O4的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染能力及外加磁場(chǎng)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　 3、設(shè)計(jì)1對(duì)引物,以pHSV-106質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后獲得目的基因片段,與pD3

5、SX載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿E.coliDH5α,克隆PCR法篩選菌落,測(cè)序鑒定后,大量抽提質(zhì)粒。磁性轉(zhuǎn)染法將pHSP-HSV-TK導(dǎo)入SMMC-7721,加熱處理后,RT-PCR法檢測(cè)TK基因的整合。
　　 4、通過蛋白交聯(lián)固化的方法制備丙氧鳥苷白蛋白納米微球,并測(cè)定GCV-BSA-NP的體外釋藥特性；采用預(yù)錫化直接標(biāo)記法對(duì)丙氧鳥苷白蛋白納米微球進(jìn)行了188Re標(biāo)記,同時(shí)觀察188Re-GCV-BSA-NP體外穩(wěn)定性；建立VX2肝

6、癌模型并將36只荷瘤兔隨機(jī)分成6組,分別為(A)空白對(duì)照組、(B)單純加熱組、(C)單純基因轉(zhuǎn)染治療組、(D)碘油混合基因轉(zhuǎn)染治療組、(E)碘油混合基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合放療組、(F)基因、熱療、核素內(nèi)照射聯(lián)合治療組；各組經(jīng)介入治療后,觀察腫瘤生長(zhǎng)增殖情況,計(jì)算腫瘤體積增長(zhǎng)率,觀察腫瘤組織病理變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、自制的Mn0.4Zn0.6Fe2O4納米粒近似球形,大小較一致,直徑約為30～60nm,有部分團(tuán)聚現(xiàn)象,

7、XRD圖對(duì)比粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)(JCPDS)編制的尖晶石型錳鋅鐵氧體納米粒卡片(PowderdiffractionFile)可知自制的Mn0.4Zn0.6Fe2O4納米粒為尖晶石型錳鋅鐵氧體納米粒；SEM-EDS證實(shí)Mn0.4Zn0.6Fe2O4納米粒只含有Mn、Zn、Fe、O四種元素且構(gòu)成比與分子式近乎一致；VSM曲線中磁滯回線雙線合一,說明Mn0.4Zn0.6Fe2O4納米粒為超順磁納米材料；MTT顯示該材料對(duì)L-929細(xì)胞毒性為0

8、～1級(jí)；無(wú)溶血作用；其LD50值為6.026g/kg;微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)致畸致突變作用；兔肝臟穿刺注射Mn0.4Zn0.6Fe2O4納米粒磁流體后心、肝、脾、肺、腎組織形態(tài)和肝、腎等血生化指標(biāo)均無(wú)明顯改變,顯示該材料是一種具有良好生物相容性的材料,應(yīng)用于腫瘤熱療具有廣闊前景。
　　 2、修飾后的磁性納米粒子具有良好的分散性、磁響應(yīng)性及升溫恒溫能力；紅外光譜及XPS分析驗(yàn)證了PEI在磁性納米粒子表面的吸附;修飾后磁性納米粒子的等電

9、點(diǎn)由pH7.0移至pH11.0；具有良好的DNA結(jié)合保護(hù)轉(zhuǎn)染能力；在體內(nèi)外,PEI/Mn0.4Zn0.6Fe2O4可將外源基因成功轉(zhuǎn)染并表達(dá);在體外,外加磁場(chǎng)可使轉(zhuǎn)染效率提高5～10倍。
　　 3、獲得重組的真核表達(dá)質(zhì)粒pHSP-HSV-TK;經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段分子量與預(yù)計(jì)的相同；插入pD3SX載體部位正確,經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)插入片段兩端序列無(wú)改變,且讀碼框正確；轉(zhuǎn)染pHSP-HSV-TK的SMMC-7721擴(kuò)增出正確的TK

10、基因條帶。
　　 4、丙氧鳥苷白蛋白納米微球?yàn)榇笮〔坏鹊囊?guī)則性微粒,直徑不等,但多集中在250nm-290nm;GCV-BSA-NP總的標(biāo)記率>90％,放化純>95％；標(biāo)記物穩(wěn)定性觀察:標(biāo)記物放置于37℃的PBS(pH7.4)溶液中,在24h時(shí)放化純?yōu)?5％；成功建立VX2肝癌模型,且VX2肝癌模型的建立對(duì)肝腎功能沒有明顯的影響；介入治療后12天,各組腫瘤體積均有增長(zhǎng)；單純加熱組與碘油混合基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合放療組相比,12天后腫瘤生長(zhǎng)

11、無(wú)顯著性差異,但腫瘤增長(zhǎng)率均大于基因、熱療、核素內(nèi)照射聯(lián)合治療組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；碘油混合基因轉(zhuǎn)染治療組較單純基因轉(zhuǎn)染治療組腫瘤體積生長(zhǎng)明顯降低,且差異有顯著性(P<0.05)；介入治療后12天,C、D、E、F四個(gè)治療組的腫瘤體積增長(zhǎng)較對(duì)照組均有顯著性差異(P<0.05),且以基因、熱療、核素內(nèi)照射聯(lián)合治療組的治療效果最好,也即腫瘤體積增長(zhǎng)率最低；但單純基因轉(zhuǎn)染治療組與空白對(duì)照組相比,腫瘤體積生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異(P>0

12、.05)。
　　 結(jié)論:熱療、基因聯(lián)合放療能有效抑制VX2肝癌的生長(zhǎng),對(duì)肝癌治療有潛在的應(yīng)用前景。
　　 1、自制納米級(jí)Mn0.4Zn0.6Fe2O4磁性納米粒子是一種具有良好生物相容性的材料,應(yīng)用于腫瘤熱療具有廣闊前景。
　　 2、PEI修飾的磁性納米顆粒是一種可用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染的新型非病毒基因載體,外加磁場(chǎng)可提高其轉(zhuǎn)染效率。
　　 3、pHSP-HSV-TK質(zhì)粒構(gòu)建成功,為利用其進(jìn)行靶向性基因治療研究奠