河北省腸道病毒71型的病原特征研究.pdf

1、目的：
　　 1.了解河北省腸道病毒71型（EV71）在手足口病（HFMD）實(shí)驗(yàn)室診斷病例和重癥病例中的感染情況，為進(jìn)行HFMD的流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 2.分析河北省EV71分離株的基因型別，為采取針對性的控制措施，完善我國EV71的基因型和亞型分類資料，及時(shí)監(jiān)測本地區(qū)的EV71流行株以及進(jìn)行疫苗的研制打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.通過流行病學(xué)調(diào)查，采集HFMD臨床診斷病例的

2、咽拭子、皰疹液、糞便、腦脊液和血清標(biāo)本。
　　 2.針對腸道病毒（EV）5’端非編碼區(qū)保守基因序列以及EV71 VP1區(qū)基因序列設(shè)計(jì)EV通用引物和EV71型特異引物，通過RT-PCR擴(kuò)增檢測HFMD臨床診斷病例的標(biāo)本，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
　　 3.將RT-PCR檢測為EV71陽性的HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例標(biāo)本接種RD細(xì)胞分離病毒；選用EV71型特異引物通過RT-PCR對出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）的標(biāo)本進(jìn)行毒株鑒定，

3、挑選18株EV71陽性的毒株作為河北省EV71的代表株。
　　 4.針對EV71的VP1區(qū)全核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR擴(kuò)增18株EV71代表株的VP1區(qū)，純化回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并測定其序列，用DNASTAR軟件進(jìn)行核苷酸序列同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對河北省EV71代表株的基因亞型進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用RT-PCR法共檢測HFMD臨床診斷病例1005份標(biāo)本，594份標(biāo)本EV陽性，陽性率

4、為59.1％，293份標(biāo)本EV71陽性，陽性率為29.2％。其中共檢測皰疹液標(biāo)本138份，59份EV71陽性，陽性檢出率為42.8％；糞便標(biāo)本7份，2份EV71陽性，陽性檢出率為28.6％；咽拭子標(biāo)本840份，232份EV71陽性，陽性檢出率為27.6％；腦脊液和血清標(biāo)本中均未檢出EV71。
　　 2.可以從不同時(shí)間采集的HFMD臨床診斷病例標(biāo)本中檢出EV71，其采集的時(shí)間分布為：從咽拭子標(biāo)本中檢出的時(shí)間分布為0-10天，中位數(shù)

5、為2天；從皰疹液標(biāo)本中檢出的時(shí)間分布為0-11天，中位數(shù)為2天；從糞便標(biāo)本中檢出的時(shí)間分布為3-5天，中位數(shù)為4天。
　　 3.將RT-PCR檢測為EV71陽性的HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例201份標(biāo)本接種RD細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，出現(xiàn)CPE的標(biāo)本經(jīng)RT-PCR鑒定，其中74份為EV71陽性，分離率為36.8％。糞便標(biāo)本接種95份，分離38份，分離率為40.0％；咽拭子標(biāo)本接種70份，分離19份，分離率為27.1％；皰疹液標(biāo)本接種31份，

6、分離17份，分離率為54.8％；腦脊液標(biāo)本接種5份，沒有分離出EV71毒株。
　　 4.522例HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例中，244例為EV71感染者，感染率為46.7％，其中217例為輕癥病例，占EV71感染者的88.9％，具有HFMD的一般表現(xiàn)：發(fā)熱和皮疹；27例為重癥病例，占EV71感染者的11.1％，具有神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的并發(fā)癥。
　　 5.522例HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例中，482例為輕癥病例，其中217例為EV7

7、1感染者，感染率為45.0％；40例為重癥病例，其中27例為EV71感染者，感染率為67.5％。
　　 6.在EV71感染者中，男性156例，占EV71感染者的63.9％，女性88例，EV71感染者的36.1％，男性：女性為1.77：1，男性EV71感染率為46.4％，女性EV71感染率為47.3％；EV71感染者中年齡最小為4月，最大為17歲，其中0歲組有1例感染者，占總感染人數(shù)的0.4％，1～3歲組167例，占總感染人數(shù)的6

8、8.4％，4～6歲組65例，占總感染人數(shù)的26.7％，7～17歲組11例，占總感染人數(shù)的4.5％；在職業(yè)分布中，以散居兒童為主，占78.81％，幼托兒童占16.02％，學(xué)生占4.83％，其它占0.34％。
　　 7.河北省18株EV71代表株之間VP1區(qū)核苷酸序列同源性為95.2％～100％；與臺(tái)灣分離株VP1區(qū)同源性在88.8％～90％之間，與浙江省、上海市、深圳市、重慶市、北京市和阜陽市分離株VPI區(qū)同源性較高，在94.6％

9、～99.4％之間；與A、B基因型代表株VPl區(qū)同源性差異較大，分別在81.4％～83.1％、83.8％～85.1％之間，與C基因型代表株VP1區(qū)同源性比較接近，在88.1％～98.4％之間；與已知基因型C1、C2、C3、C4代表株的同源性分別在89.5％～91.4％、89.1％～90.2％、88.1％～89％、96.3％～98.4％之間。
　　 8.EV71毒株基因分型及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，河北省代表株為C4亞型，與中國大陸分離

10、株的流行一致。
　　 結(jié)論：
　　 1. RT-PCR可以直接檢測HFMD臨床診斷病例的標(biāo)本，可用于HFMD病原的早期快速診斷。
　　 2標(biāo)本類型不同，EV71的陽性檢出率不同，皰疹液標(biāo)本的EV71陽性檢出率高于咽拭子標(biāo)本的檢出率；常規(guī)檢測中也可用糞便標(biāo)本來檢測EV71病毒；最好采集發(fā)病一周之內(nèi)的皰疹液、咽拭子和糞便標(biāo)本來檢測EV71。
　　 3皰疹液、咽拭子和糞便標(biāo)本均可接種RD細(xì)胞分離EV71病毒，皰

11、疹液標(biāo)本的病毒分離率高于咽拭子標(biāo)本的分離率。
　　 4.EV71病毒是HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例的主要病原之一，能夠引起輕癥病例和重癥病例的發(fā)生，以輕癥病例為主，而且重癥病例的EV71感染率高于輕癥病例的EV71感染率。
　　 5.男性和女性均可感染EV71發(fā)生HFMD，EV71的感染率無性別差異；1～3歲組兒童是EV71感染的主要人群，4～6歲組次之，以散居兒童為主。
　　 6.EV71毒株基因分型及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析