青稞差減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及冷誘導(dǎo)基因的克隆和轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)研究.pdf

1、溫度是限制植物地域分布的一個(gè)主要因素，大多數(shù)植物在低溫下一般會(huì)遭到不同程度的傷害，全球每年由于低溫凍害造成的作物損失巨大。因此，研究并提高植物的抗寒性具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 近年來(lái)，由于生物技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，大量與抗寒相關(guān)的基因被分離和鑒定出來(lái)，并證明其中部分基因?qū)μ岣咧参锏目购杂幸欢ㄗ饔谩Ｍ瑫r(shí)，初步提出了低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控路徑的模型，從而為采用基因工程手段進(jìn)行植物抗寒育種及有關(guān)生理研究提供了新的啟示。 青稞

2、，又稱裸大麥，是一種禾本科作物，主要分布于青藏高原地區(qū)。與其他禾本科作物相比，青稞對(duì)極端環(huán)境脅迫，尤其是對(duì)低溫脅迫的抵抗能力較強(qiáng)，是一個(gè)潛在的遺傳資源庫(kù)，研究并開(kāi)發(fā)這些抗低溫相關(guān)基因及其調(diào)控機(jī)制將具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。為此，本文以青稞作為實(shí)驗(yàn)材料，在建立起其組織培養(yǎng)離體再生體系的基礎(chǔ)上，對(duì)其冷誘導(dǎo)相關(guān)基因進(jìn)行了研究，結(jié)果如下： Ⅰ．以青稞成熟胚為外植體，對(duì)外植體作兩種處理：(1)成熟胚外帶部分胚乳(E)；(2)成熟胚不帶

3、胚乳(NE)。兩種成熟胚均接種在含不同濃度2，4-D(1～5 mg/L)的MS培養(yǎng)基上。暗培養(yǎng)7 d后，白色疏松的愈傷組織出現(xiàn)，同時(shí)，在外植體E中部分胚直接長(zhǎng)出芽，胚的發(fā)芽率隨2，4-D濃度的升高呈下降趨勢(shì)。在兩種外植體中，愈傷組織誘導(dǎo)率存在一定差異。外植體NE產(chǎn)生的愈傷組織明顯高于外植體E，在2，4-D濃度為3 mg/L時(shí)，其誘導(dǎo)率可達(dá)93.1％。愈傷組織在含2 mg/L 2，4-D的激素條件下繼代培養(yǎng)1代后轉(zhuǎn)入含不同濃度6-BA(1

4、～5mg/L)和500 mg/L CH的MS培養(yǎng)基上，21 d后愈傷組織表面開(kāi)始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。與愈傷組織誘導(dǎo)相反，來(lái)源于外植體E的愈傷組織的分化率高于外植體NE的愈傷組織，在含2 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，計(jì)有65.2％的愈傷組織可分化出苗。轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基上則可誘導(dǎo)出根。研究建立了青稞成熟胚離體誘導(dǎo)再生植株的實(shí)驗(yàn)體系。 Ⅱ．采用PCR法從青稞中克隆了hblt14.2基因，與大麥的blt14.2基因具有98.9％的同源

5、性，在蛋白質(zhì)上存在2個(gè)氨基酸的差別。hblt14.2基因共有470個(gè)核苷酸，其中包括249 bp的開(kāi)放閱讀框，69 bp的5 非翻譯區(qū)和152 bp的3非翻譯區(qū)。該基因編碼一個(gè)82個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為7.71 kDa，等電點(diǎn)為7.03。氨基酸組成表明，該蛋白富含Gly(17.07％)、Ala(15.85％)、Leu(13.41％)和Val(9.76％)氨基酸，是一種高度親水的小分子蛋白。hblt14.2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以豐富的α-

6、螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，與其他冷誘導(dǎo)基因在氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有相似性。采用RT-PCR方法研究了青稞力hblt14.2基因在低溫、鹽脅迫以及ABA處理下的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果表明，只在4℃低溫處理下的幼苗中檢測(cè)到了hblt14.2基因的表達(dá)，而在鹽脅迫和ABA處理的幼苗中未檢測(cè)到，推測(cè)hblt14.2基因?yàn)橐粋€(gè)專一低溫誘導(dǎo)基因。此外，RT-PCR分析顯示，hblt14.2基因的表達(dá)可能具有組織特異性，它在葉片中的表達(dá)量很高，但在根中未

7、檢測(cè)到該基因的表達(dá)。 將hblt14.2基因連上強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S和終止子后定向插入質(zhì)粒pCAMBIAl30l的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA-BI-hblt。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，將連有啟動(dòng)子和終止子的目的基因轉(zhuǎn)入普通煙草。PCR和Southern檢測(cè)表明，目的基因已整合到煙草基因組中。RT-PCR檢測(cè)表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中獲得了轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。 采用酶法分離了轉(zhuǎn)基因煙草及其對(duì)照

8、植株的葉肉原生質(zhì)體，在相同條件下作低溫脅迫培養(yǎng)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草原生質(zhì)體存活率略高于對(duì)照植株，低溫脅迫35 d后，轉(zhuǎn)基因植株原生質(zhì)體存活率為56.7％，而對(duì)照植株為43.2％。低溫處理1 w后，在轉(zhuǎn)基因植株的原生質(zhì)體中出現(xiàn)了1次細(xì)胞分裂，而在對(duì)照植株中未出現(xiàn)。此外，對(duì)低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草及其對(duì)照植株的葉片脯氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草中的脯氨酸含量低于對(duì)照植株。在低溫處理72 h后，對(duì)照葉片中脯氨酸含量為1.22 mg/

9、g，而轉(zhuǎn)基因煙草中只有0.57 mg/g。分析認(rèn)為，可能是hblt14.2基因在煙草中的高效表達(dá)，在一定程度上提高了植株對(duì)低溫的抵抗力，從而使另一條抗低溫代謝途徑--脯氨酸合成途徑被削弱。由上述結(jié)果推測(cè)，青稞hblt14.2基因與植物的抗寒性有一定關(guān)系。 Ⅲ.以4℃低溫處理的幼苗為實(shí)驗(yàn)方(Tester)，室溫生長(zhǎng)的幼苗為驅(qū)動(dòng)方(Driver)，通過(guò)抑制差減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建了包含240個(gè)單克隆的青稞差減cDNA文庫(kù)。從文庫(kù)中

10、隨機(jī)取出32個(gè)克隆進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，結(jié)果表明87.5％的克隆中含有插入片段。對(duì)其中16個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得12個(gè)不重復(fù)cDNA序列，片段平均大小為452 bp。序列比對(duì)顯示，這些片段與其他植物的下列基因具有一定的同源性：金屬硫蛋白、蛋白激酶、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子、bzip轉(zhuǎn)錄因子、鋅指轉(zhuǎn)錄因子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、富含亮氨酸蛋白、果糖二磷酸酶、銅鋅超氧化物岐化酶、核糖體蛋白、鈉氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過(guò)氧化氫酶、NADPH-細(xì)胞色素還原酶、抗