慢性腎小球腎炎病證結(jié)合唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)，選擇西醫(yī)確診慢性腎小球腎炎（CGN）患者，根據(jù)病證結(jié)合分組，并與體檢正常的健康人群對(duì)照，進(jìn)行唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究，初步建立慢性腎小球腎炎腎虛證的診斷模型；并從蛋白質(zhì)組水平初步探討中醫(yī)同病異證的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)；建立具有中醫(yī)特色無創(chuàng)傷的唾液蛋白質(zhì)組診斷技術(shù)，進(jìn)一步推動(dòng)微觀辨證學(xué)的發(fā)展和促進(jìn)中醫(yī)診斷學(xué)的現(xiàn)代化。
　　方法:采集88例唾液標(biāo)本，其中正常對(duì)照者45例均為

2、健康體檢正常者。所有疾病患者均經(jīng)過腎活檢病理檢查明確診斷。按病證結(jié)合分為以下兩大組：（1）慢性腎小球腎炎與正常組：比較慢性腎小球腎炎患者與正常對(duì)照者蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異。（2）中醫(yī)同病異證分組：即以證候?yàn)榫V進(jìn)行分組，全部病例按中醫(yī)虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)分為脾虛、腎虛、脾腎兩虛和非脾腎虛4組，與正常組對(duì)照進(jìn)行研究。采用液態(tài)芯片（WCX磁珠）制備唾液樣品，結(jié)合MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對(duì)所有慢性腎小球腎炎患者和正常對(duì)照組的唾液進(jìn)行蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測(cè)。

3、設(shè)定所有唾液樣本檢測(cè)的蛋白質(zhì)采集分子量相對(duì)范圍為2000~25000Da，對(duì)每個(gè)組合內(nèi)的相同質(zhì)荷比不同含量的蛋白進(jìn)行分析比較，找到組合內(nèi)蛋白含量有顯著差異的質(zhì)荷比峰。所得到蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比峰值用Biomarker Wizard3.0軟件過濾噪音，將軟件處理后的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰強(qiáng)度值資料導(dǎo)入Biomarker Pattern Software5.0.2，采用決策樹算法，確定最佳的篩選模型。選出組合內(nèi)含量有顯著差異的蛋白質(zhì)波峰初步建立相應(yīng)疾病、證

4、候及病證結(jié)合的唾液蛋白質(zhì)組診斷模型。將全部標(biāo)本用隨機(jī)數(shù)字表法分為學(xué)習(xí)訓(xùn)練組和驗(yàn)證組，用所建立的診斷模型分別在學(xué)習(xí)模式和測(cè)試模式下對(duì)樣本進(jìn)行分類診斷，對(duì)測(cè)試組標(biāo)本在測(cè)試模式下進(jìn)行雙盲檢測(cè)，驗(yàn)證和評(píng)估所建立診斷模型的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，綜合評(píng)價(jià)其診斷效率。
　　結(jié)果:（1）按西醫(yī)疾病分組：正常對(duì)照組與慢性腎小球腎炎組兩組樣本共88例，對(duì)所有的樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較，兩個(gè)組共得到蛋白質(zhì)峰為410個(gè)，其中224個(gè)統(tǒng)計(jì)差異顯著的蛋白

5、峰，選擇質(zhì)荷比（m/z）為7101.90Da和2616.91Da兩個(gè)蛋白質(zhì)峰進(jìn)行建模，識(shí)別率為93.02％，預(yù)測(cè)能力91.11%。臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果，43例慢性腎小球腎炎患者中有35例被準(zhǔn)確檢出為慢性腎小球腎炎，45例正常組中有36例被準(zhǔn)確檢出為非慢性腎小球腎炎。結(jié)果表明，該診斷模型的準(zhǔn)確率為80.68%（71/88），靈敏度為81.40%（35/43），特異度為80.00%（36/45）。（2）按中醫(yī)同病異證分組：將慢性腎小球腎炎患者按

6、照中醫(yī)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)分為脾虛、腎虛、脾腎兩虛3組，和45例正常對(duì)照組共81例。①虛證組與正常組對(duì)比：1）將脾虛組和正常對(duì)照組的唾液樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較，得到具有統(tǒng)計(jì)差異的蛋白質(zhì)峰共155個(gè)，通過遺傳算法找到3個(gè)差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）分別為：7101.905Da、3641.061Da、3931.962Da；2）分析比較腎虛組和正常對(duì)照組的唾液樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖，共得到227個(gè)具有統(tǒng)計(jì)差異的蛋白質(zhì)峰。通過遺傳算法找到腎虛患者有3

7、個(gè)蛋白質(zhì)峰，質(zhì)荷比（m/z）分別為：2431.669Da、4660.730Da、7101.905Da顯著高于正常人，建立診斷模型，識(shí)別率為90.00%，預(yù)測(cè)能力97.78%。臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果，21例慢性腎小球腎炎腎虛證患者中有18例被準(zhǔn)確檢出為腎虛證，45例正常組中有42例被準(zhǔn)確檢出為非腎虛證。該診斷模型的準(zhǔn)確率為90.91%（60/66），靈敏度為85.71%（18/21），特異度為93.33%（42/45）；3）分析對(duì)比脾腎兩虛組和

8、正常對(duì)照組的唾液樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖，共得到具有統(tǒng)計(jì)差異的蛋白質(zhì)峰103個(gè)，通過遺傳算法找到2個(gè)差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）分別為：7101.905Da、2616.913Da。②虛證組組間對(duì)比：1）對(duì)脾虛組和腎虛組樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較，共得到具有統(tǒng)計(jì)差異的蛋白質(zhì)峰35個(gè)，通過遺傳算法找到1個(gè)差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：2952.974Da；2）對(duì)脾虛組和脾腎兩虛組樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較，共得到具有統(tǒng)計(jì)差異的蛋白質(zhì)峰32

9、個(gè)，通過遺傳算法找到1個(gè)差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：2102.998Da；3）對(duì)腎虛組和脾腎兩虛組樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較，共得到具有統(tǒng)計(jì)差異的蛋白質(zhì)峰12個(gè)，通過遺傳算法找到1個(gè)差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：3872.561Da。
　　結(jié)論:本研究運(yùn)用液態(tài)芯片結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)慢性腎小球腎炎患者與正常對(duì)照組的睡液蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)譜檢測(cè)，從唾液蛋白質(zhì)組初步篩選出可用于慢性腎小球腎炎病證結(jié)合診斷的具有特