MCF7細(xì)胞中haS-miR-103靶向CARM1基因的初步研究.pdf

1、隨著現(xiàn)在社會(huì)的不斷進(jìn)步，人們生活方式、飲食習(xí)慣以及環(huán)境因素的變化，我國乳腺癌發(fā)病率在近30年中每年約增長2％-3％，成為威脅女性健康的“頭號(hào)癌癥殺手”，衛(wèi)生部已將乳腺癌列為我國腫瘤防治的重點(diǎn)之一。乳腺癌表現(xiàn)為乳房腫塊、乳頭溢液、乳頭凹陷;乳頭瘙癢、脫屑、糜爛、潰瘍、結(jié)痂等乳頭改變，形態(tài)上可以出現(xiàn)酒窩征、“橘皮征”等，并出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大。乳腺癌容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以肺、胸膜、骨、腦、肝轉(zhuǎn)移多見。
　　 隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)及其在細(xì)胞

2、內(nèi)的作用機(jī)制不斷深入研究，miRNAs在乳腺癌中的調(diào)控作用越來越受到重視，它能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲、轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)發(fā)揮著類似于癌基因和抑癌基因的作用。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中證明MicroRNA-103促進(jìn)腫瘤生長與侵襲的作用。本實(shí)驗(yàn)希望通過慢病毒介導(dǎo)的方法，將構(gòu)建成功的pLVTHM-miR103載體轉(zhuǎn)染到對人乳腺癌MCF7細(xì)胞，并對miR103是否靶向于Carm1進(jìn)行初步鑒定，為后續(xù)的功能學(xué)研究打下基礎(chǔ)，從而對最終的臨床干預(yù)

3、治療提供一定參考價(jià)值。
　　 目的:構(gòu)建慢病毒載體pLVTHM-miR103，包裝慢病毒，測定滴度，鑒定miR103對Carm1的靶向作用。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為三部分。1.通過文獻(xiàn)挖掘找到在HER2(+)/(-)乳腺癌組織中表達(dá)不同的MicroRNAS，采用三種不同的生物信息預(yù)測軟件對其靶向的基因進(jìn)行預(yù)測，找到可能性最大的靶基因CARM1。2.擴(kuò)增hsa-miR-103的前體片段，與pLVTHM同時(shí)經(jīng)過XhoⅠ和Not

4、Ⅰ雙酶切，使用T4 DNA連接酶連接入pLVTHM質(zhì)粒中，測序正確后，將目的片段轉(zhuǎn)接于pLVTHM質(zhì)粒，再次測序驗(yàn)證。構(gòu)建好的質(zhì)粒與PMD2.G、psPAX2兩個(gè)輔助質(zhì)粒使用脂質(zhì)體2000導(dǎo)入293T細(xì)胞，包裝出慢病毒。同時(shí)進(jìn)行慢病毒滴度測定。3.pLVTHM-miR103慢病毒的獲取及MCF7細(xì)胞中miR-103與融合基因CARM1靶向關(guān)系的初步鑒定。
　　 結(jié)果:通過自行設(shè)計(jì)引物，以正常人全血基因組DNA為模板，利用PCR技

5、術(shù)成功克隆了表達(dá)hsa-miR-103的基因片段，經(jīng)測序驗(yàn)證正確;成功構(gòu)建了表達(dá)hsa-miR-103的重組慢病毒質(zhì)粒pLVTHM-miR-103，該重組質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定特異地表達(dá)hsa-miR-103，并獲取了慢病毒上清，具備再感染目的細(xì)胞的能力;利用所獲得的慢病毒上清感染MCF7細(xì)胞，并利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與westem blotting對感染后MCF7細(xì)胞中hsa-miR-103及CARM1表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。