硫黃熏蒸對白芷化學成分、藥效和安全性影響的研究.pdf

1、白芷來源為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss) Shan et Yuan的干燥根，是一味常用中藥。白芷主產(chǎn)于我國四川、河北、安徽、河南等省，一直以來，白芷的產(chǎn)地加工是一個突出的生產(chǎn)難題。白芷采收

2、后若不及時干燥，極易腐爛變質，目前全國各地的白芷產(chǎn)地加工均采用硫黃熏蒸。硫黃熏蒸雖對不易干燥或易發(fā)霉、變質、生蟲的中藥材具有殺菌防腐、漂白、增加色澤美感等作用，但大量研究表明，熏硫造成中藥材性味劣變，生物活性組分損失及有害物質殘留，硫黃熏蒸對藥材質量帶來的負面影響已引起人們的高度關注。本文針對硫黃熏蒸前后及不同熏硫程度對白芷藥材化學成分、藥效和安全性的影響，二氧化硫殘留量的變化規(guī)律及熏硫加工的規(guī)范化問題，在前期研究的基礎上，運用多學科的

3、技術方法，通過系統(tǒng)深入的研究，為白芷硫黃熏蒸加工方法的合理性、規(guī)范化及制定科學合理、客觀可控的有效成分和外源性有害物質二氧化硫殘留量的限量標準提供科學依據(jù)。研究結果如下：
　　1.不同熏硫程度白芷的加工及藥材外觀性狀對比分析
　　根據(jù)前期白芷主產(chǎn)區(qū)調研，進行了不同硫黃用量、不同熏蒸時間的加工試驗，用產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)搭灶的方式共制備不同熏硫程度白芷樣品21個，為本文研究的順利進行提供了保障。通過對不同熏硫程度白芷外觀性狀的對比觀察，發(fā)

4、現(xiàn)熏硫與未熏硫白芷的主要區(qū)別在顏色、斷面特征、氣味等方面。硫黃熏蒸后的白芷表面顏色稍淺，斷面類白色，粉性較強，形成層環(huán)和油點不甚明顯，略帶酸味，但不同熏硫程度的白芷上述特征存在一定差異，隨著硫黃用量和熏蒸時間的增加，斷面顏色逐漸變白，形成層環(huán)及棕色油點等特征逐漸消失。硫黃熏蒸對白芷的外觀性狀產(chǎn)生了一定的影響。從白芷的外觀性狀上，可以直觀的判斷白芷是否熏硫以及估計其硫黃熏蒸的程度。
　　2.首次進行了不同熏硫程度白芷二氧化硫殘留量的

5、動態(tài)檢測
　　按照《中國藥典》2010版附錄項下的方法對不同熏硫程度白芷的二氧化硫殘留量進行了動態(tài)檢測。硫黃熏蒸過的樣品二氧化硫殘留量是自然曬干的樣品的幾百甚至上千倍，硫黃用量為25g、100g、200g/10kg藥材和熏蒸時間為18h的樣品其二氧化硫殘留量符合國家規(guī)定的150mg/kg的限量標準。本研究為白芷硫黃熏蒸加工中熏硫程度的確定提供了參考依據(jù)。硫黃用量和硫黃熏蒸時間與二氧化硫殘留量雖未呈現(xiàn)出良好的線性關系，但從總體上，隨

6、著硫黃用量的增加和熏蒸時間的延長，二氧化硫殘留量也有所增加。
　　3.對不同熏硫程度白芷的化學成分進行了系統(tǒng)的對比分析
　　在薄層色譜鑒別方面，確立以氯仿-乙酸乙酯（10:1）和環(huán)己烷-氯仿-乙醚（4:1:2）進行二次展開的色譜條件，對22批不同程度硫黃熏蒸白芷及未熏硫白芷樣品進行薄層色譜對比。氧化前胡素是白芷熏硫與否的一個指標性成分，從薄層色譜圖上可較為直觀的鑒別白芷是否熏硫。
　　在高效液相指紋圖譜分析方面，建立2

7、2批不同程度硫黃熏蒸白芷 HPLC指紋圖譜，校正后得到的對照色譜中19個共有峰，其中確認了11個化合物。由于硫黃熏蒸程度的不同，在共有峰的峰面積上有差異。對比熏硫與未熏硫白芷的圖譜，發(fā)現(xiàn)兩者在色譜峰數(shù)量及峰面積上有差異。通過統(tǒng)計分析，未熏硫白芷與熏硫白芷聚為兩類，主成分分析綜合評分熏硫白芷得分較低，質量較差。從HPLC指紋圖譜上也能直觀的判斷出白芷熏硫與否。
　　首次進行不同熏硫程度白芷LC-MS分析，建立不同熏硫程度白芷的藥材、

8、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的LC-MS分析方法，得到白芷香豆素類化合物不同的變化規(guī)律。三個不同的極性部位，硫黃熏蒸對石油醚、乙酸乙酯部位的影響與對藥材的影響類似，對正丁醇部位的影響較大，新增加的峰多而明顯。
　　首次進行不同程度硫黃熏蒸白芷GC-MS分析，在前期的研究基礎上，建立了不同程度硫黃熏蒸白芷揮發(fā)油的GC-MS分析方法。不同程度硫黃熏蒸白芷的揮發(fā)油中共鑒定出67種化合物。其中有4種共有成分，分別為：2,6-二叔丁

9、基對甲基苯酚，棕櫚酸乙酯，亞油酸乙酯，十六碳烷基十四烷酸酯。隨著硫黃熏蒸程度的不同，白芷中揮發(fā)油的種類也發(fā)生了變化，產(chǎn)生了很多新的化合物，四個共有成分變化不一。
　　對不同熏硫程度白芷的浸出物和指標性成分進行含量測定，隨著硫黃用量和熏蒸時間的增加，，白芷的浸出物含量比未熏硫白芷下降28.5％~47.3%，氧化前胡素和歐前胡素的含量總體呈下降趨勢。自然曬干樣品的浸出物、氧化前胡素、歐前胡素含量明顯高于其他經(jīng)過硫黃熏蒸的樣品。

10、　　4.首次對熏硫與未熏硫白芷的進行體內血漿的HPLC圖譜對比研究
　　通過采血時間、采血部位、給藥劑量等方面的考察，建立了白芷血漿HPLC分析方法，對比了熏硫與未熏硫白芷體內血漿的HPLC圖譜。未熏硫白芷給藥后的血漿HPLC圖譜中出現(xiàn)了12個色譜峰，其中有2個峰可能是代謝產(chǎn)生的峰。熏硫白芷入血成分較未熏硫白芷少，入血成分峰面積、總峰面積較低，并且尚未出現(xiàn)代謝產(chǎn)生的峰。本研究為白芷藥效物質基礎的研究奠定了基礎。
　　5.首次

11、采用藥效學結合血漿藥物化學的方法對熏硫與未熏硫白芷進行藥效評價
　　分別采用經(jīng)典的二甲苯致小鼠耳腫脹和醋酸致小鼠扭體法對硫黃熏蒸前后白芷進行抗炎、鎮(zhèn)痛的實驗。在藥效學指標上未熏硫白芷高劑量表現(xiàn)出顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，而熏硫白芷部分劑量組顯示出抗炎鎮(zhèn)痛作用，但無統(tǒng)計學意義。各個劑量組的血漿成分類似但也有所不同。隨著給藥劑量的減小，各劑量組入血成分的峰面積也相應減小。推測水合氧化前胡內酯可能是白芷鎮(zhèn)痛、抗炎的藥效物質基礎，為闡明白芷的

12、譜效關系奠定了基礎。
　　6.進行了熏硫與未熏硫白芷急性毒性試驗
　　通過對熏硫與未熏硫白芷的急性毒性試驗，以評價其安全性。結果表明，單次灌胃給藥未熏硫白芷LD50為52.41 g生藥/kg，即約相當于臨床用量的353倍；單次灌胃給予硫黃熏蒸白芷的最大耐受量為123.6g生藥/kg，即約相當于臨床用量的832倍。雖然兩者均在安全使用的范圍，可以安全使用，但是未熏硫白芷的毒性明顯比硫黃熏蒸白芷的毒性大。
　　7.首次進行

13、了不同熏硫程度白芷化學成分、藥效及安全性的相關性分析
　　用曲線回歸的方法探討了二氧化硫殘留量分別與氧化前胡素、歐前胡素的關系，建立了二者的模型方程，相關性良好。氧化前胡素與二氧化硫殘留量二者呈對數(shù)相關為Y=0.085-0.011lnX；歐前胡素與二氧化硫殘留量二者呈三次方相關，關系式為Y=0.176+3.150×10-7X2-1.666×10-10 X3。
　　探討了白芷抗炎、鎮(zhèn)痛的譜效關系，用經(jīng)典的二甲苯致小鼠耳腫脹法、

14、醋酸致小鼠扭體法評價熏硫與未熏硫的白芷得到的藥效數(shù)據(jù)，與各劑量組的血漿 HPLC指紋圖譜色譜峰峰面積進行多元相關分析。將各劑量組的色譜峰峰面積進行主成分分析，求得各組的綜合評分后，用綜合評分C作為自變量，藥效學指標作為因變量 Y做曲線回歸，預測二者的關系，建立相關方程。綜合抗炎、鎮(zhèn)痛兩個藥理譜效關系結果，血漿主成分分析的綜合評分與抗炎、鎮(zhèn)痛的藥效學指標呈正相關。
　　根據(jù)熏硫與未熏硫白芷急性毒性結果，結合白芷體外、體內化學成分分析

15、，推斷引起白芷毒性的可能是與有效成分相關的內源性物質，至于是白芷中的原型成分還是代謝產(chǎn)物引起的毒性還需要進一步的研究。雖然熏硫白芷的毒性較未熏硫白芷低，但外源性有害物質二氧化硫殘留量明顯增加，影響用藥的安全性，故應規(guī)范白芷硫黃熏蒸的加工方法。
　　8.通過本文研究，為闡明白芷硫黃熏蒸加工方法的合理性、確定合適的熏硫程度以及制定科學合理、客觀可控的有效成分及二氧化硫限量標準提供了科學依據(jù)
　　研究發(fā)現(xiàn)，白芷熏硫后雖然影響有效成