超聲-微泡法介導(dǎo)外源性基因在細(xì)胞系和動物體內(nèi)定向性表達(dá)的研究.pdf

1、南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文超聲微泡法介導(dǎo)外源性基因在細(xì)胞系和動物體內(nèi)定向性表達(dá)的研究姓名：郭冬平申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：范樂明陳琪20060420南京醫(yī)科大學(xué)博士論文／微泡條件下，報(bào)告基因在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系和小鼠心肌中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率。激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞分析技術(shù)用于檢測細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)效率。蟲熒光素酶活性的測定用來評價(jià)外源基因在小鼠心肌中的表達(dá)效率。同時(shí)通過對細(xì)胞活性的檢測以及小鼠血漿生化檢測對本基因轉(zhuǎn)移

2、系統(tǒng)的安全性進(jìn)行評價(jià)。低密度脂蛋白受體基因在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)為了構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體LDLRpcDNAHis，人低密度脂蛋白受體基因的cDNA編碼序列被插入到質(zhì)粒表迭載體pcDNAmychis—A的多克隆位點(diǎn)。LDLRpcDNAHis和pLDLR—EGFPNl兩種質(zhì)粒表達(dá)載體分別制備純化，純化后的質(zhì)粒DNA與微泡進(jìn)行混合。質(zhì)粒與微泡的混合液體加入到培養(yǎng)有人肝癌細(xì)胞(HepG2)的六孔板中，并對細(xì)胞進(jìn)行超聲照射。轉(zhuǎn)染結(jié)束后流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染

3、效率。將DiI標(biāo)記的人低密度脂蛋白(LDL)加入到轉(zhuǎn)染外源性LDLR的培養(yǎng)板中，檢測細(xì)胞內(nèi)外源性人低密度脂蛋白受體是否具有正常的攝取配體的功能。最后westemblot檢測LDLRhis融合蛋白的表達(dá)情況。含有肝臟特異性啟動子的質(zhì)粒表迭載體在小鼠肝臟中的表達(dá)用含有六氟化硫氣體的微泡與超聲相結(jié)合，介導(dǎo)嵌合有肝臟特異性啟動子和增強(qiáng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體在小鼠肝臟中表達(dá)。在不同超聲微泡條件下檢測報(bào)告基因蟲熒光素酶在小鼠不同臟器中的表達(dá)，特別是肝臟申