外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔腹主動脈球囊損傷后內(nèi)皮修復及內(nèi)膜增生影響的實驗研究.pdf

1、1.背景與目的： 迄今靶病變血管再狹窄(RS)仍然是經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術后最主要的問題之一。Forrester等提出，支架內(nèi)RS的主要原因是血管內(nèi)膜損傷后，自身愈合過程導致的新生內(nèi)膜增生，是血管內(nèi)皮修復和內(nèi)膜增殖的對立平衡失調(diào)的結(jié)果。當前對于RS的防治主要集中在藥物、基因治療、介入治療以及外科手術等方面，雖然這些治療手段從一定程度上減輕了RS所造成的危害，但對于血管損傷處的內(nèi)皮修復和抑制內(nèi)膜增生的作用仍難以令人滿意。如何

2、尋找一種更佳的方法促進血管損傷后再內(nèi)皮化和抑制過度的新生內(nèi)膜增殖，從而達到預防和治療RS的目的是當今的研究熱點。 眾多的研究相繼證實內(nèi)源性電場廣泛存在于損傷愈合、組織再生、胚胎發(fā)育以及腫瘤的形成等生理或病理生理過程。在機體自身產(chǎn)生的生物電場不足以促進損傷愈合的過程時，在損傷區(qū)與非損傷區(qū)之間施加直流電場可以增強損傷愈合速率。內(nèi)皮損傷在增殖性血管疾病發(fā)病中起始動和促進作用，平滑肌細胞( VSMCs)的增殖和遷移是構(gòu)成血管新生內(nèi)膜增生

3、的直接原因。有研究發(fā)現(xiàn)，生理強度直流電場對血管內(nèi)皮細胞的多種生物學行為產(chǎn)生影響。外加電場還可以誘導血管內(nèi)皮細胞肌動蛋白細胞骨架F-actin合成和裝配，進而影響細胞運動行為。研究表明外加電場可以影響VSMCs的定向遷移，這種作用是與細胞生長相關的一種主動行為，而不是在電場作用下的一種被動的泳動。離體實驗發(fā)現(xiàn)外加電場也可以影響VSMCs的增殖。內(nèi)源性電場也存在于血管周圍，在體情況下，適宜的外加電場可以改善電場作用局部的動脈粥樣硬化程度。因

4、此，在體情況下外加低壓穩(wěn)恒直流電場是否會影響血管周圍的內(nèi)源性電場，是否會影響血管損傷后的修復過程值得探討。 本課題小組已在前期研究中初步探討了穩(wěn)恒直流電場對培養(yǎng)VSMCs的作用及機制，并設計了電場作用于實驗動物的電源裝置。在此基礎上，本課題進一步將穩(wěn)恒直流電場作用于血管損傷動物模型，研究其對血管損傷后新生內(nèi)膜增生以及血管再內(nèi)皮化的影響及其機制。 2.方法： 第一部分初步探討外加低壓穩(wěn)恒直流電場作用于血管時的可行性

5、及安全有效的方式。 (1)將自制的鉑電極置于家兔腹主動脈兩側(cè)腰大肌內(nèi)，或?qū)K電極分別置于腹主動脈血管內(nèi)和家兔頸背部，觀察不同電場作用方式、不同電場強度下血管局部損傷情況的變化。 (2)將兩自制鉑電極置于家兔腹主動脈兩側(cè)腰大肌內(nèi)作為刺激電極，通過多對測量電極觀察不同電壓強度下兔腹主動脈周圍電勢差的變化情況。 第二部分將健康日本大耳白兔65只，隨機分為假手術組、對照組、實驗組，其中實驗組分為3.0V、4.0V兩個亞組

6、。建立兔腹主動脈球囊損傷模型，將自制的鉑電極置于家兔腹主動脈兩側(cè)腰大肌內(nèi)，根據(jù)分組情況給與實驗組相應的穩(wěn)恒直流電場刺激，于術后1周，術后2周，術后4周處死動物。通過伊文氏藍染色、CD31免疫組化、掃描電鏡來觀察血管再內(nèi)皮化情況；觀察各組離體血管環(huán)對不同濃度乙酰膽堿的最大舒張反應，判斷血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；通過HE染色，天狼猩紅染色以及Westem-blot來觀察血管新生內(nèi)膜增生情況和I型、III型膠原蛋白的表達。 第三部分通過

7、PCNA免疫組化和TUNEL法觀察外加穩(wěn)恒直流電場刺激后血管平滑肌細胞增殖和凋亡情況變化，通過免疫組化、Western-blot和實時定量PCR來觀察電場刺激后P27和PTEN的表達變化。 3.結(jié)果 (1)將鉑絲電極置入血管內(nèi)，連接血管外電極和電源可構(gòu)成透壁電場。此干預方式使用1.OV電壓刺激即可灼傷血管內(nèi)膜。由于電極置入血管內(nèi)，極易引起血栓的形成。 (2)將鉑電極置入兔腹主動脈兩側(cè)腰大肌，連接電源后構(gòu)成平面電場

8、，此干預方式比較安全。通電后即刻血管外膜間和血管內(nèi)外膜問的電勢差不會馬上發(fā)生改變；通電后30分鐘，3.0V和4.0V組血管外膜間和血管內(nèi)外膜間的電勢差與通電前相比均顯著升高(P<0.01)；斷開電源30分鐘后，3.OV和4.OV組血管內(nèi)外膜間的電勢差仍高于通電前(P<0.01)，兩刺激電極間仍能保持較高的電勢差。 (3)伊文氏藍染色結(jié)果顯示3.0V組和4.0V組各時間點內(nèi)皮再生面積/損傷總面積比值與對照組相比均無顯著差異(P>0

9、.05)。4.OV電場干預4周后血管環(huán)對Ach的最大舒張反應高于對照組和3.0V組(P<0.05)，其余時間點血管環(huán)對Ach的最大舒張反應與對照組和3.0V組比較均無顯著差異。 (4)在球囊損傷后2周和4周，3.0V組和4.0V組內(nèi)/中膜面積比值均顯著小于對照組，3.0V組和4.0V組之間比較無顯著差異(P>0.05)。天狼猩紅染色顯示3.0V組和4.0V組血管新生內(nèi)膜中I型、III型膠原蛋白的表達低于對照組。 (5)在

10、兔腹主動脈球囊損傷模型，血管內(nèi)膜損傷后血管壁的細胞凋亡水平較低，3.OV或4.OV外加穩(wěn)恒直流電場干預后細胞凋亡未見增加； (6)在球囊損傷后2周，3.0V組和4.0V組PCNA陽性增殖細胞指數(shù)均顯著小于對照組(P<0.01)，球囊損傷后4周電場干預組與對照組相比增殖細胞指數(shù)間均無顯著差異(P>0.05)； (7)3.0V和4.0V外加穩(wěn)恒直流電場均可以上調(diào)血管損傷后P27的表達； (9)血管球囊損傷后，PTEN

11、的表達下降，給予3.0V或4.0V外加穩(wěn)恒直流電場干預后，血管壁內(nèi)PTEN蛋白的表達上調(diào)。 4.結(jié)論 (1)外加穩(wěn)恒直流電場干預不會影響血管損傷后的再內(nèi)皮化速度，4.0V電場干預4周后血管內(nèi)皮依賴性舒張功能較對照組和3.OV組有改善，提示適宜的外加電場可能有利于內(nèi)皮功能的恢復。 (2)適宜的外加穩(wěn)恒直流電場可以抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的增生，同時也抑制了新生內(nèi)膜內(nèi)I型、III型膠原蛋白的表達。 (3)外加穩(wěn)