女性生育力保存方法探索-ICSI周期中未成熟卵母細胞的再利用研究.pdf

1、第一部分低氧及個體化方案對ICSI周期中人未成熟卵母細胞體外成熟效果的影響
　　目的：探討低氧(5％O2)環(huán)境及個體化體外成熟方案對控制性超排卵周期中人未成熟卵母細胞IVM結(jié)果的影響。
　　方法：共收集ICSI周期中成熟失敗人卵母細胞556枚,并隨機分為兩組:常氧組(20%O2)319枚未成熟人卵母細胞,行IVM;低氧組(5%O2)237枚未成熟人卵母細胞。經(jīng)體外培養(yǎng),成熟后卵母細胞行ICSI。ICSI后16～18h觀察第二

2、極體排出及原核形成情況,挑選出正常受精卵繼續(xù)培養(yǎng)至擴張囊胚,期間觀察和記錄IVM后卵母細胞的成熟、2PN、2PN卵裂、D3-優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)目并計算相應的比率。根據(jù)未成熟卵體外成熟方案,常氧組(20%O2)和低氧組(5%O2)又分別被隨機分成兩組:常規(guī)IVM組未成熟人卵母細胞入IVM液,在37℃、6%CO2、20%O2及飽和濕度的條件下培養(yǎng),36h后體視顯微鏡下挑選出發(fā)育至MII期的卵母細胞,隨后行ICSI;個體化IVM組人卵

3、母細胞在相同條件下培養(yǎng)4h后,每間隔2h在倒置顯微鏡下觀察卵母細胞第一極體排出情況,挑出排出第一極體的卵母細胞入受精液中,同一條件下培養(yǎng)4h后行ICSI,剩余未成熟卵重復以上的觀察和處理,整個試驗中未成熟卵的最長體外成熟時間限定為36h。ICSI后16～18h觀察第二極體排出及原核形成情況,挑選出正常受精卵繼續(xù)培養(yǎng)至擴張囊胚,期間觀察和記錄IVM后卵母細胞的成熟、2PN、2PN卵裂、D3-優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)目并計算相應的比率。試

4、驗中所有的優(yōu)質(zhì)囊胚均行兩輪FISH共8種染色體(13,15,16,18,21,22,X,Y)進行檢測。第1輪FISH13、21、22、16、18探針分別被紅、綠、金、青、藍熒光所標記,第2輪FISH15、X、Y探針分別被綠,橙,青熒光所標記。
　　結(jié)果：常氧組(20%O2):GV期+MI期卵母細胞319枚,IVM成熟258枚,ICSI后受精227枚,雙原核(2PN)201枚,2PN卵裂184枚,D3-優(yōu)質(zhì)胚胎30枚,囊胚22枚,其

5、中優(yōu)質(zhì)囊胚4枚;低氧組(5%O2):GV期+MI期卵母細胞237枚,IVM成熟194枚,ICSI后受精179枚,雙原核(2PN)162枚,2PN卵裂153枚,D3-優(yōu)質(zhì)胚胎53枚,囊胚37枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚9枚。兩組間比較:成熟率、受精率、2PN率、2PN卵裂率及優(yōu)質(zhì)囊胚率經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異(P>0.05),D3-優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚率呈極顯著性差異(P<0.01,x2=15.13;P<0.01,x2=8.65)。20%O2培養(yǎng)條件下,

6、常規(guī)IVM組卵母細胞112枚,IVM成熟94枚,ICSI后受精84枚,雙原核(2PN)76枚,2PN卵裂70枚,D3-優(yōu)質(zhì)胚胎10枚,囊胚6枚,未獲得優(yōu)質(zhì)囊胚;個體化IVM組卵母細胞207枚,IVM成熟164枚,ICSI后受精143枚,雙原核(2PN)125枚,2PN卵裂114枚,D3-優(yōu)質(zhì)胚胎20枚,囊胚16枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚4枚。兩組間比較:成熟率、受精率、2PN率、2PN卵裂率、D3-優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著

7、性差異(P>0.05),但個體化IVM組的囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率明顯高于常規(guī)IVM組(14.0%Vs8.57%;25.0%Vs0)。5%O2培養(yǎng)條件下,常規(guī)IVM組卵母細胞100枚,IVM成熟78枚,ICSI后受精72枚,雙原核(2PN)68枚,2PN卵裂65枚,D3-優(yōu)質(zhì)胚胎10枚,囊胚6枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚2枚;個體化IVM組卵母細胞137枚,IVM成熟116枚,ICSI后受精107枚,雙原核(2PN)94枚,2PN卵裂88枚,D3-優(yōu)質(zhì)胚

8、胎43枚,囊胚31枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚7枚。兩組間比較:成熟率、受精率、2PN率、2PN卵裂率及優(yōu)質(zhì)囊胚率經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異(P>0.05),D3-優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚率呈極顯著性差異(P<0.01,x2=18.51;P<0.01,x2=13.78)。試驗中共獲得13枚優(yōu)質(zhì)囊胚,均成功固定,低氧組(5%O2)獲得9枚優(yōu)質(zhì)囊胚,非整倍體胚胎4枚,非整倍體發(fā)生率44.4%。常氧組(20%O2)獲得4枚優(yōu)質(zhì)囊胚,異常2枚,異常率50%。兩組異常

9、胚胎率相當,差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：低氧(5%O2)的體外培養(yǎng)環(huán)境及有利于ICSI周期人未成熟卵母細胞的體外成熟、受精及所獲胚胎的發(fā)育;個體化的體外成熟方案有利于人未成熟卵母細胞體外成熟及受精后所獲胚胎的發(fā)育;ICSI周期中人未成熟卵母細胞通過IVM,ICSI及早期胚胎培養(yǎng)能獲得八種染色體正常的優(yōu)質(zhì)囊胚?？傊?控制性超促排卵周期中人未成熟卵母細胞在5%O2濃度的體外培養(yǎng)條件下,經(jīng)過個體化方案的體外成熟,受精

10、及早期胚胎培養(yǎng)能獲得較為滿意的IVM結(jié)果,實現(xiàn)了未成熟卵母細胞的再利用。
　　第二部分冷凍方法、乙醇激活及海藻糖應用對ICSI周期中人未成熟卵母細胞凍融后發(fā)育潛力的影響
　　一、冷凍方式對ICSI周期人未成熟卵母細胞凍融后發(fā)育潛力的影響研究
　　目的：冷凍方式對ICSI周期中人未成熟卵母細胞凍融后存活、成熟、受精、胚胎發(fā)育的影響。
　　方法：共收集ICSI周期中成熟失敗人卵母細胞454枚,并隨機分為兩組。慢速冷凍

11、組:192枚未成熟卵母細胞,其中GV70和MI122枚,行人未成熟卵凍融;玻璃化冷凍組:262枚卵母細胞(GV92枚,MI170枚)。未成熟卵凍融后,挑選出存活的卵母細胞行體外成熟培養(yǎng),成熟后卵母細胞行ICSI,ICSI后16～18h觀察第二極體排出及原核形成情況,挑選出正常受精卵繼續(xù)培養(yǎng)至擴張囊胚,期間觀察和記錄卵母細胞的存活、成熟、2PN、2PN卵裂、D3-優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)目并計算相應的比率。
　　結(jié)果：慢冷組卵母細

12、胞(GV+MI)凍融后的總存活率顯著低于玻璃化組(62.0%Vs82.4%),且經(jīng)統(tǒng)計學檢驗呈顯著性差異(P<0.01,c2=23.99)。慢冷組GV,MI卵母細胞存活率分別為85.7%和48.4%,玻璃化組分別為93.5%和76.5%。綜合兩組,GV期卵母細胞凍融后存活率顯著高于MI期卵母細胞(90.1%Vs64.7%),且經(jīng)統(tǒng)計學檢驗呈顯著性差異(P<0.01,c2=34.75)。慢冷組凍融后GV,MI期卵母細胞IVM的成熟率分別是

13、16.7%(10/60)和50.8%(30/59),而玻璃化組分別是24.4%和55.4%。綜合兩組,凍融后總的GV期卵母細胞經(jīng)過36hIVM培養(yǎng)獲得21.2%的體外成熟率,顯著低于總的MI的體外成熟率(54.0%),差異有顯著性(P<0.01,x2=36.87);慢冷組119枚存活的卵母細胞(包括GV+MI)中,40枚發(fā)育成熟;玻璃化組216枚中,93枚成熟。成熟率方面:玻璃化組的43.1%(93/216)高于慢冷組的33.6%(40

14、/119),但兩者之間經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異(P>0.05,c2=1.26)。慢冷組10枚凍融后GV期卵母細胞IVM成熟后ICSI,沒有獲得受精;而玻璃組21枚GV期卵母細胞經(jīng)IVM成熟后獲得受精卵4枚,受精率為19.0%。凍融后MI期卵母細胞經(jīng)IVM成熟后ICSI,其中,慢冷組12枚受精,受精率為36%(12/30),玻璃化組44枚受精,受精率是61.1%(44/72),但兩組MI期卵母細胞經(jīng)IVM后ICSI,受精率經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯

15、著性差異(P>0.05)。綜合兩組,凍融后MI期卵母細胞經(jīng)IVM成熟后ICSI,其受精率(58.8%)顯著高于GV期卵母細胞經(jīng)IVM后ICSI的受精率(12.9%),差異呈極顯著性(P<0.01,c2=8.61)。在玻璃化組,凍融后GV期卵母細胞最終未獲得卵裂期胚胎。在慢冷組,凍融后MI期卵母細胞獲得12枚受精卵,體外培養(yǎng)后最終獲得2枚卵裂期胚胎,但均發(fā)育阻滯于2細胞階段;而在玻璃化組,凍融后MI期卵母細胞行IVM后ICSI及體外培養(yǎng)后

16、獲得22枚卵裂期胚胎,并最終獲得5枚囊胚。提示MI期卵母細胞IVM后行ICSI所獲得的胚胎卵裂率,玻璃化組顯著高于慢速冷凍組(50.0%Vs16.7)。
　　結(jié)論：凍融人未成熟卵母細胞,玻璃化冷凍法優(yōu)于慢速冷凍法,且GV期卵母細胞比MI期卵母細胞更能耐受低溫和冷凍保護劑的影響,但MI期卵母細胞玻璃化凍融后經(jīng)IVM、ICSI及胚胎培養(yǎng)能獲得較為滿意的胚胎。
　　二、乙醇激活/海藻糖應用與ICSI周期人未成熟卵母細胞凍融后發(fā)育潛

17、力
　　目的：乙醇激活及海藻糖應用對ICSI周期中人未成熟卵母細胞凍融后存活、成熟、受精、胚胎發(fā)育及胚胎非整倍體發(fā)生的影響
　　方法：納入本試驗中所有成熟失敗人卵母細胞被隨機分為:蔗糖玻璃化組,274枚未成熟卵使用含蔗糖為冷凍保護劑的凍融液進行凍融研究;海藻糖玻璃化組,245枚未成熟卵使用含海藻糖為冷凍保護劑的凍融液進行凍融;對照組(新鮮組),291枚未成熟卵未經(jīng)冷凍直接行體外成熟培養(yǎng)。隨后又根據(jù)體外成熟卵ICSI后是否進行

18、乙醇激活,將以上三個研究組進一步分成六組,分別為:蔗糖玻璃化未激活組,蔗糖玻璃化激活組;海藻糖玻璃化未激活組,海藻糖玻璃化激活組,新鮮未激活組及新鮮激活組。期間觀察和記錄凍融后卵母細胞的存活、成熟、2PN、2PN卵裂、D3-優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)目并計算相應的率。試驗中所有的優(yōu)質(zhì)囊胚均行兩輪FISH共8種染色體(13,15,16,18,21,22,X,Y)進行檢測。第1輪FISH13、21、22、16、18探針分別被紅、綠、金、青、

19、藍熒光所標記,第2輪FISH15、X、Y探針分別被綠,橙,青熒光所標記。
　　結(jié)果：新鮮未激活組(GV+MI):112枚卵直接行IVM方案,94枚成熟,76枚受精,70枚卵裂,優(yōu)質(zhì)胚胎10枚及形成囊胚6枚,未獲優(yōu)質(zhì)囊胚;新鮮激活組(GV+MI):179枚未成熟卵,IVM成熟152枚,,ICSI后行乙醇激活,激活后受精130枚,卵裂率124枚,優(yōu)質(zhì)胚胎39枚,形成囊胚25枚及優(yōu)質(zhì)囊胚14枚。蔗糖玻璃化未激活組(GV+MI):未成熟卵

20、母細胞128枚,解凍后存活110枚,IVM成熟100枚,ICSI后受精82枚,卵裂48枚,未獲優(yōu)質(zhì)胚胎及囊胚;蔗糖玻璃化激活組(GV+MI):未成熟卵母細胞146枚,解凍后存活124枚,IVM后成熟104枚,ICSI卵激活后受精86枚,56發(fā)生卵裂,形成優(yōu)質(zhì)胚胎16枚,形成囊胚8枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚4枚。新鮮激活組與新鮮未激活組比較:成熟、受精及卵裂率之間無差異(P>0.05),優(yōu)質(zhì)胚胎率經(jīng)統(tǒng)計學檢驗呈顯著性差異(31.5%Vs14.3%,

21、P<0.01,c2=6.98),囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率間差異有統(tǒng)計學意義(20.2%Vs8.6%,P<0.05,c2=4.48;56.0%Vs0,P<0.05,c2=6.13);玻璃化未激活組與玻璃化激活組比較,優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚率分別經(jīng)統(tǒng)計學檢驗呈顯著性差異(28.6%Vs0%,P<0.01,c2=16.21;14.3%Vs0,P<0.01,c2=7.43),且激活組獲得4枚優(yōu)質(zhì)囊胚。新鮮激活組與玻璃化激活組相比:成熟、受精,優(yōu)質(zhì)胚胎,囊胚

22、及優(yōu)質(zhì)囊胚率之間無差異(P>0.05),但新鮮組卵裂率(95.4%)顯著高于玻璃化組(65.1%),經(jīng)統(tǒng)計學檢驗呈顯著性差異(P<0.01,c2=34.14);新鮮未激活組和玻璃化未激活組相比:新鮮組卵裂率,優(yōu)質(zhì)胚胎率及囊胚率分別高于玻璃化組(92.1%Vs58.5%;14.3%Vs0;8.6%Vs0),差異分別有統(tǒng)計學意義(P<0.01,c2=23.51;P<0.01,c2=7.49;P<0.05,c2=4.33)。
　　海藻糖

23、玻璃化組:125枚未成熟卵,凍融后108枚存活,IVM后98枚成熟,ICSI后82枚受精,培養(yǎng)后45枚發(fā)生卵裂,5枚發(fā)育為優(yōu)質(zhì)胚胎,3枚發(fā)育至囊胚,但未獲得優(yōu)質(zhì)囊胚;海藻糖玻璃化激活組:未成熟卵母細胞120枚,解凍后存活100枚,IVM后成熟87枚,ICSI卵激活后受精70枚,38枚發(fā)生卵裂,形成優(yōu)質(zhì)胚胎13枚,囊胚形成10枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚6枚。海藻糖玻璃化組與蔗糖玻璃化組相比:存活、成熟、受精,卵裂、優(yōu)質(zhì)胚胎,囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚率之間無差

24、異(P>0.05),同樣海藻糖玻璃化組與蔗糖玻璃化激活相比各參數(shù)間也無差異(P>0.05)。
　　新鮮激活組和玻璃化激活組共獲得24枚優(yōu)質(zhì)囊胚,均成功固定,新鮮組14枚優(yōu)質(zhì)囊胚,異常胚胎5枚,異常胚胎率35.7%;蔗糖玻璃化激活組4,異常3枚,非整倍體發(fā)生率75%;海藻糖玻璃化激活組6枚,3枚被檢測出為非整倍體,發(fā)生率50%。分別與新鮮組相比,非整倍體率相當,無差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：ICSI周期中人未成熟卵母細胞

25、在凍融過程中遭受損傷,降低其形成胚胎的潛力,人工輔助激活不能促進胚胎的形成,但有利于所獲胚胎后期更好的發(fā)育;在人未成熟卵母細胞的凍融過程中,與蔗糖相比其凍融效果相當。
　　第三部ICSI周期中人未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)成熟凍融后紡錘體結(jié)構(gòu)的觀察
　　目的：通過共聚焦顯微鏡觀察人未成熟卵母細胞經(jīng)IVM獲得成熟卵子凍融后超微結(jié)構(gòu)的狀態(tài),旨在分析此類卵子在凍融過程中的冷凍損傷。
　　方法：共收集62枚新鮮人未成熟卵母細胞,行I

26、VM,51枚發(fā)育至MII期,選出42枚形態(tài)正常的MII卵隨機分為兩組:IVM-蔗糖組,20枚卵經(jīng)過含蔗糖的玻璃化液凍融后行共聚焦顯微鏡觀察,分析紡錘體結(jié)構(gòu)變化;IVM-海藻糖組,22枚應用海藻糖玻璃化液冷凍;對照組,共收集20枚IVF周期中形態(tài)正常的MII卵(患者鑒定知情同意,同意贈卵):2枚直接行固定和隨后的紡錘體觀察,另18枚,9枚行蔗糖,9枚行海藻糖玻璃化凍融及紡錘體觀察。
　　結(jié)果：IVM成熟卵母細胞42枚,20枚應用蔗糖

27、玻璃化液冷凍,解凍后,存活17枚(IVM-蔗糖組);22枚應用海藻糖玻璃化液冷凍,解凍后,存活19枚(IVM-海藻糖組);IVF-蔗糖組成活8枚,IVF-海藻糖組存活8枚。四組間的存活率經(jīng)統(tǒng)計學檢驗無顯著性差異(P>0.05),四組存活的卵母細胞分別固定染色體,有效固定的卵母細胞數(shù)分別為:IVM-蔗糖組10枚,IVM-海藻糖組11枚,IVF-蔗糖組6枚及IVF-海藻糖組7枚,染色體與紡錘體形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常分別有3枚(30.0%)、4枚(3