基于碳納米管復合材料的心肌組織工程研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于冠狀動脈血液供應急劇減少或中斷導致的心肌缺血性壞死。心肌組織本身的再生能力非常有限，一旦壞死后，室壁進行病理性重建，壞死的心肌被纖維化的瘢痕組織取代，導致心肌收縮功能減弱甚至喪失，嚴重時引起死亡。目前，心肌梗死在臨床中的主要治療方法包括介入治療、藥物治療、冠狀動脈旁路手術以及心臟移植等等，但是這些方法均存在明顯的局限性。例如，介入治療、藥物治療與冠狀動脈

2、旁路手術只能在一定程度上緩解癥狀，而心臟移植則面臨供體不足、移植后免疫排斥及并發(fā)癥較多等難以解決的問題。因此，探索新的治療策略與方法已成為目前缺血性心臟疾病治療研究領域的迫切任務之一。
　　隨著干細胞、生物材料與組織工程各研究領域的不斷發(fā)展與交叉融合，針對受損心肌組織修復與重建的心肌組織工程研究近年來進展迅速，為缺血性心臟疾病的治療帶來了新的希望。種子細胞、支架材料及工程化心肌組織構建與移植是心肌組織工程研究的主要內(nèi)容。
　

3、　在種子細胞方面，干細胞是心肌組織工程研究的重要細胞來源。在過去的研究中，已有多種類型的干細胞被用于心肌組織工程研究，主要包括胚胎干細胞(ESCs)，誘導型多能干細胞(iPSCs)以及多種類型的組織干細胞。盡管這些種子細胞均表現(xiàn)出一定的心梗治療潛能，但研究發(fā)現(xiàn)這些細胞在治療應用中也存在一定的局限性，例如:ESCs存在免疫原性及倫理方面的問題;iPSCs具有致瘤性風險;間充質干細胞的成心肌分化能力低;心臟干細胞來源有限等等。到目前為止，理

4、想的種子細胞來源在科學界仍未達成共識，因而尋找新的干細胞來源是當前心肌組織工程研究的熱點之一。近年來的研究表明，棕色脂肪組織來源的干細胞(brown adipose tissue derived stem cells，BASCs)中含有豐富的心臟干細胞，具有較高的成心肌分化潛能。同時，體內(nèi)移植研究也發(fā)現(xiàn)，BASCs移植到缺血性心肌后可以分化為心肌細胞，減少心梗面積，改善左室功能。因此，BASCs在心肌再生研究中具有重要的潛在應用價值，是

5、心肌組織工程研究中重要的種子細胞來源之一。然而，由于發(fā)現(xiàn)時間較短，關于BASCs在心梗治療中的應用還有待于深入研究。
　　在支架材料方面，研制合適的支架材料是心肌組織工程的關鍵環(huán)節(jié)。近年來，生物材料與納米技術的迅速發(fā)展得到了研究人員的高度關注，其在心肌組織工程中的應用也成為了當前研究的熱點之一。納米材料與傳統(tǒng)支架材料的成功整合已經(jīng)成為優(yōu)化傳統(tǒng)支架材料、使其具備特殊理化性質的重要手段。鑒于心肌組織具有獨特的電生理特性，心肌內(nèi)分布著交

6、織成網(wǎng)狀的具有電傳導性的浦肯野氏纖維。單個心肌細胞接受心臟傳導系統(tǒng)傳來的電沖動產(chǎn)生興奮和收縮偶聯(lián)，心室肌作為一個整體，發(fā)生同步收縮，完成泵血功能。因此，理想的心肌組織工程支架材料應該可以模擬心肌的胞外基質微環(huán)境;具有電傳導特性及適宜的力學特性。然而，傳統(tǒng)的支架材料不具備導電特性，而導電納米材料與傳統(tǒng)支架材料進行整合后，能夠明顯提高復合支架材料的導電性。因此，將具有導電性的納米材料整合入傳統(tǒng)支架材料的策略，引起了研究人員的極大興趣。

7、>　　碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)是一種圓柱狀片層結構，具有優(yōu)良的力學強度、導電特性及熱穩(wěn)定性。通過不同的方法與其他材料制備成復合材料后，可以使CNTs的溶解性增加、生物相容性改善、細胞毒性降低以及在很大程度上改善復合材料的力學性能及導電性能。與多壁碳納米管(multi-wall carbonnaotubes，MWCNTs)相比，單壁碳納米管(single-wall carbon naotubes，SWCNTs

8、)的直徑分布范圍小，管壁缺陷少，具有更好的均勻一致性。SWCNTs的直徑約為0.6-2nm，長度為微米級，比表面積較大。目前，在組織工程領域中，基于CNTs的復合導電性納米支架材料已經(jīng)得到了廣泛的應用，并受到研究人員的高度關注。
　　在心肌組織構建與移植方面，主要有兩種途徑，分別為可注射性心肌組織工程及工程化心肌補片。
　　可注射性心肌組織工程:是指在心肌損傷部位，將可注射性支架材料單獨注射或與細胞和/或生長因子復合后注射，

9、促進受損心肌功能修復的一種策略?？勺⑸湫灾Ъ懿牧蠑y帶干細胞在心梗區(qū)域移植后，材料對心梗微環(huán)境有很好的改善作用，移植的細胞可以促進心肌的再生，而且，這種方法具有不用制備特殊支架及低侵襲性等特點，易于在臨床上應用，因此，可注射性心肌組織工程是一個重要的研究方向。
　　用于心梗治療的可注射性材料有很多種，如纖維蛋白，膠原，Matrigel，藻酸鹽，自組裝多肽及殼聚糖等。然而，這些材料都存在一定的缺點。近年來，聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠(

10、poly N-isopropylacrylamide，PNIPAAm)的成膠特點及良好的生物相容性在臨床上引起了人們的關注。PNIPAAm的相變溫度(lowercritical solution temperature，LCST)為32℃，當PNIPAAm低于LCST時，流動性好，便于在器官、組織或體腔中注射;而在正常體溫下，這種聚合物可以在原位快速形成凝膠。而且，PNIPAAm具有良好的生物相容性，可用于獲取細胞片層。然而，將SWCN

11、Ts與PNIPAAm制備成水凝膠用于心梗治療的研究目前尚未見報道。
　　工程化心肌補片:可以為細胞提供合適的微環(huán)境及結構支撐，促進移植細胞的分化，并可防止細胞凋亡。因此，心肌補片在心梗治療中得到了廣泛的關注并成為一個重要的研究方向。然而，大量研究均關注的是工程化心肌補片的構建與移植應用，對心肌補片影響心肌組織本身所其有的特化功能結構——閏盤(intercalated disc，ID)的研究，則鮮有報道。
　　ID存在于心肌細

12、胞之間，是心肌細胞之間連接和通訊的重要結構，與心肌的電傳導及節(jié)律性收縮密切相關，主要由粘著連接、橋粒和縫隙連接組成。其中，粘著連接和橋粒主要負責心肌細胞間的力學耦聯(lián);縫隙連接則與心肌細胞間的電耦聯(lián)和代謝耦聯(lián)相關。三者缺一不可，相輔相成，保證ID功能的正常發(fā)揮。我們前期曾以膠原/Matrigel水凝膠材料復合新生大鼠心肌細胞(neonate ratventricular myocytes，NRVM)體外構建了工程化心肌組織片層，深入研究了

13、在ID自組裝形成過程中，三種連接的時空分布規(guī)律。然而，對于SWCNTs構建的導電性工程化心肌組織片層，對心肌細胞間ID形成、組裝與極化影響的報道，目前尚未見到。
　　基于上述分析，本論文從心肌組織工程研究的兩個重要策略入手，開展以下兩方面的研究。一方面，以PNIPAAm/SWCNTs構建可注射性支架材料，攜帶BASCs體內(nèi)移植后對受損心肌進行功能修復的研究。另一方面，以SWCNTs/膠原復合支架構建工程化心肌組織補片，并研究SWC

14、NTs對再造心肌ID形成、組裝及功能成熟的影響。因此，本論文的研究內(nèi)容分為兩個部分:
　　第一部分:基于PNIPAAm/SWCNTs水凝膠的可注射性心肌組織工程研究
　　本研究首先制備了PNIPAAm/SWCNTs水凝膠，對其理化性能、細胞相容性及組織相容性進行了評價;并以BASCs為種子細胞，以PNIPAAm/SWCNTs水凝膠為可注射性支架材料，評估了PNIPAAm/SWCNTs水凝膠對體外培養(yǎng)的BASCs黏附、伸展及增

15、殖的影響;另外，PNIPAAm/SWCNTs水凝膠攜帶BASCs心梗區(qū)域移植后，通過超聲心動圖及組織學等方法，評估了心梗后受損心肌的功能改善情況，并通過免疫熒光染色觀察了BASCs在心梗區(qū)域的滯留及轉歸情況。
　　結果表明:與對照組PNIPAAm水凝膠相比，PNIPAAm/SWCNTs水凝膠的表面粗糙度明顯增加，并具有優(yōu)良的導電性。PNIPAAm/SWCNTs水凝膠具有良好的細胞相容性及組織相容性;體外培養(yǎng)條件下可以促進BASCs

16、的黏附與增殖;在H2O2（作為外源性活性氧自由基，ROS）存在條件下，同樣可以增加BASCs的黏附與伸展;利用PNIPAAm/SWCNTs水凝膠作為可注射性支架材料，攜帶BASCs心梗區(qū)域注射后，可以提高BASCs滯留率，增加室壁厚度，減少室壁梗死面積，抑制左室重建，改善心梗后受損心肌的功能。
　　第二部分:基于SWCNTs/膠原的工程化心肌補片構建及SWCNTs影響再造心肌ID發(fā)育的研究
　　本研究中，我們采用鼠尾Ⅰ型膠原

17、與SWCNTs制備成復合支架，對其理化性質和生物相容性進行了評價;隨后，利用篩選出的SWCNTs/膠原復合支架(0.1 mg/mL)作為基質，與NRVM共培養(yǎng)，構建了工程化心肌補片;在此基礎上，我們對SWCNTs影響再造心肌補片ID組裝、形成及功能發(fā)揮進行了研究。在不同時間點，通過免疫熒光染色、western blotting、透射電鏡及NRVM的自發(fā)鈣瞬變等方法，從形態(tài)學、分子生物學、超微結構和功能上，對再造心肌ID的蛋白表達、分布、

18、組裝與發(fā)育情況進行了評價。
　　結果表明:當SWCNTs的濃度為0.1mg/mL時，SWCNTs在膠原溶液中分散均勻，沒有明顯的聚集現(xiàn)象，與掃描電鏡結果一致;隨SWCNTs濃度的增加，膠原溶液中SWCNTs出現(xiàn)不同程度的聚集;原子力顯微鏡結果說明隨SWCNTs濃度的增加，復合支架的表面粗糙度也隨之增加;對復合支架的電傳導性進行測量后，SWCNTs濃度與復合支架的導電性呈正相關。Live/Dead染色結果提示:與其他4組相比，SWC

19、NTs濃度為0.1mg/mL時對細胞活力的影響最小，說明SWCNTs/膠原(0.1mg/mL)組具有更好的生物相容性。
　　與單純膠原對照組相比，基于SWCNTs/膠原復合支架構建的工程化心肌補片，其免疫熒光染色和透射電鏡檢測結果均表明SWCNTs不但明顯增強再造心肌組織α-actinin蛋白的表達，可見明顯的肌節(jié)結構，而且顯著促進了縫隙連接蛋白Connexin43蛋白的極化，這提示基于SWCNTs/膠原再造心肌補片具有更加成熟的

20、組織結構和更好的收縮性能。同時，也證實了SWCNTs可以明顯促進再造心肌ID組裝形成與功能成熟。
　　綜上所述，一方面，本研究成功制備了基于含SWCNTs的PNIPAAm水凝膠，并將這種可注射性水凝膠與BASCs復合后用于心梗區(qū)域移植。研究發(fā)現(xiàn)，PNIPAAm/SWCNTs水凝膠體外培養(yǎng)時可以促進BASCs黏附與增殖，體內(nèi)移植后可以促進受損心肌修復，改善梗死區(qū)心臟功能。這種基于PNIPAAm/SWCNTs的可注射性水凝膠支架材料對