金屬標(biāo)記結(jié)合選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)絕對定量新方法研究.pdf

1、定量蛋白質(zhì)組學(xué)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以分為相對定量和絕對定量,其中絕對定量方法是定量蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的主要瓶頸。定量試劑盒價(jià)格昂貴,蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量特點(diǎn),內(nèi)標(biāo)肽段制備困難,實(shí)際樣本酶解不完全等問題制約著蛋白質(zhì)絕對定量方法的發(fā)展。
　　本論文針對絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)存在的問題,首先針對傳統(tǒng)溶液酶解存在的酶解時(shí)間較長、酶自切物干擾、蛋白酶不能重復(fù)使用以及實(shí)際樣本酶解不完全等問題,制備了一種新型的原子轉(zhuǎn)移自

2、由基聚合修飾銀絲固定化酶反應(yīng)器。另外還發(fā)展了金屬標(biāo)記結(jié)合選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)(SIM)的絕對定量新方法,并應(yīng)用于騰沖嗜熱菌中蛋白質(zhì)的絕對定量分析。
　　本論文由三章組成。第一章概述了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究現(xiàn)狀、化學(xué)標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜方法在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用、金屬標(biāo)記的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景、酶解對定量蛋白質(zhì)組學(xué)的影響等內(nèi)容,最后結(jié)合當(dāng)前研究背景提出了本課題的研究內(nèi)容。
　　第二章制備了一種以銀絲為載體的新型的固定化酶反應(yīng)器。采用標(biāo)準(zhǔn)

3、蛋白質(zhì)和質(zhì)譜考察了銀絲固定化酶反應(yīng)器的酶解效率、重復(fù)性和回收率。結(jié)果表明:絨毛狀聚合物修飾的銀絲固定化酶反應(yīng)器的酶解效率較高,酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA20min后,肽段的氨基酸序列覆蓋率可達(dá)93％,好于傳統(tǒng)溶液酶切方法酶切16h得到的79%的覆蓋率;使用該固定化酶反應(yīng)器在一個(gè)月內(nèi)8次酶解BSA所得的氨基酸序列覆蓋率在89%到97%之間,平均覆蓋率為94%,顯示出其具有良好的穩(wěn)定性。另外MYO的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該固定化酶的回收率為87.67%

4、。最后,銀絲固定化酶反應(yīng)器酶解騰沖嗜熱菌全蛋白20min所鑒定到的序列覆蓋率和鑒定的蛋白數(shù)量與同樣條件下溶液酶解16小時(shí)的結(jié)果接近,而零漏切位點(diǎn)肽段的比例更高,證明該固定化酶對實(shí)際樣本的酶解更加完全。
　　第三章建立了金屬標(biāo)記結(jié)合選擇性離子監(jiān)測質(zhì)譜(SIM)技術(shù)的蛋白質(zhì)絕對定量新方法。實(shí)驗(yàn)考察了金屬標(biāo)記效率、金屬標(biāo)記的穩(wěn)定性、標(biāo)記后肽段的色譜保留行為、質(zhì)譜行為、線性范圍和準(zhǔn)確度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金屬標(biāo)記具有標(biāo)記效率高,穩(wěn)定性好,色譜保