家蠶Sericin-1啟動(dòng)子中與絲膠基因表達(dá)相關(guān)區(qū)域的分析.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是一種能吐絲的經(jīng)過家養(yǎng)馴化的鱗翅目昆蟲，兼具重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和學(xué)術(shù)價(jià)值。家蠶因?yàn)槠鋸?qiáng)大的合成和分泌絲蛋白（絲素和絲膠）能力而備受人類關(guān)注,并且由于在昆蟲中相對(duì)較好的研究基礎(chǔ)以及相對(duì)簡單的飼養(yǎng)條件，使得家蠶被普遍接受為鱗翅目昆蟲的模式生物。 家蠶絲腺是合成和分泌絲蛋白的特殊器官，從形態(tài)和功能上可以分為三部分：前部絲腺（ASG）、中部絲腺（MSG）和后部絲腺（PSG）。絲蛋白的大量合成和分泌是在五齡起第3

2、日開始的，后部絲腺特異性的合成和分泌絲素蛋白，而中部絲腺特異性地合成和分泌絲膠蛋白。兩種絲蛋白基因的時(shí)間特異性和組織特異性表達(dá)現(xiàn)象，引起了研究者們廣泛的興趣?；虮磉_(dá)受多種調(diào)控因子的多級(jí)調(diào)節(jié)，其中啟動(dòng)子的調(diào)控占有十分重要的地位。因此，研究絲蛋白基因啟動(dòng)子的功能序列對(duì)于深入了解基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有十分重要的意義。 目前已有5種絲膠基因被克隆和分離，分別被稱為Ser1、Ser2、MSGS3、MSGS4和MSGS5，其中Ser1基因

3、是絲膠蛋白的主要表達(dá)基因。Liu Y等利用重組AcMNPV介導(dǎo)的體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)方法，對(duì)Ser1基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行部分刪除，通過分析EGFP報(bào)告基因的表達(dá)，研究了Ser1啟動(dòng)子序列中與絲腺組織專一性表達(dá)相關(guān)的元件[1]。 為了更加準(zhǔn)確地對(duì)家蠶絲膠1基因的啟動(dòng)子進(jìn)行研究，本文利用rAcMNPV作為基因介導(dǎo)的載體[2]，構(gòu)建了一個(gè)FHNLuc-A3RL雙熒光質(zhì)粒，其中螢火蟲熒光素酶（Fluc）基因由被研究啟動(dòng)子帶動(dòng)，另一個(gè)由家蠶acti

4、n3啟動(dòng)子控制的水母熒光素酶（Rluc）作內(nèi)參。并對(duì)Ser1啟動(dòng)子進(jìn)行了刪減、缺失后插入到Fluc前，通過分析Fluc報(bào)告基因與Rluc報(bào)告基因的熒光素酶活性，進(jìn)一步研究了Ser1啟動(dòng)子序列中與絲膠基因表達(dá)相關(guān)的區(qū)域。 首先，構(gòu)建了一個(gè)雙熒光供體質(zhì)粒，對(duì)1.6 kb的Ser1基因啟動(dòng)子進(jìn)行了5’端分段順次缺失，用PCR方法擴(kuò)增得到5種不同長度的Ser1啟動(dòng)子序列，加上Ser1基因全長啟動(dòng)子，將這5種Ser1啟動(dòng)子序列分別裝入雙熒

5、光質(zhì)粒FHNLuc-A3RL中，成功獲得6種重組的轉(zhuǎn)移載體：FSer1600Luc-A3RL，F(xiàn)Ser600Luc-A3RL，F(xiàn)Ser500Luc-A3RL，F(xiàn)Ser492Luc-A3RL，F(xiàn)Ser484Luc-A3RL和FSer475Luc-A3RL，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)[3]制備6種重組桿狀病毒Ac1600ser、Ac600ser、Ac500ser、Ac492ser、Ac484ser和Ac475ser。這些重組病毒分別注射感

6、染五齡起家蠶，測定Fluc和Rluc的酶活發(fā)現(xiàn)：Ser1啟動(dòng)子的基本轉(zhuǎn)錄元件在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游475 bp范圍內(nèi)。但長短不同的啟動(dòng)子之間，其相對(duì)活性值還是有差異的，在?1600到?475區(qū)間中也可能存在一些調(diào)控元件，但對(duì)Ser1基因的基本轉(zhuǎn)錄影響不大。 其次，為了進(jìn)一步分析Ser1啟動(dòng)子上幾個(gè)特殊的順式調(diào)控原件的作用，對(duì)上游-475啟動(dòng)子進(jìn)行了內(nèi)部部分刪除分析,其中一個(gè)是富含AT的SA區(qū)域，一個(gè)是CAAT位點(diǎn)，一個(gè)是TATA盒。使用