外源性一氧化碳對(duì)移植腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腎移植是腎功能衰竭患者的有效也是最終治療手段。目前移植腎的1年存活率已經(jīng)超過90%,但其長(zhǎng)期生存率并沒有明顯改善,接近半數(shù)的移植患者在10年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)移植腎纖維化和功能衰竭,這主要?dú)w因于移植腎臟的慢性排斥反應(yīng)。盡管具體的分子和細(xì)胞機(jī)制尚不清楚,但目前可以肯定非免疫因素和免疫因素在慢性移植物功能障礙的發(fā)病機(jī)理中都起重要作用。
　　 腎臟慢性排斥反應(yīng)的主要病理特征是以實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行性減少和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度聚集為表現(xiàn)的腎臟纖維化

2、。ECM主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。過度表達(dá)的成纖維細(xì)胞來源于發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化的腎小管上皮細(xì)胞。腎小管上皮細(xì)胞在特定條件下發(fā)生形態(tài)和功能的改變,轉(zhuǎn)化為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞,即所謂的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)。EMT的分子學(xué)表現(xiàn)為進(jìn)行性的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘素(E-cadherin)的表達(dá)下降和持續(xù)性的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)升高。
　　 研究指出TGF-β1是

3、調(diào)控腎小管EMT的關(guān)鍵細(xì)胞因子,其作用包括抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E.鈣粘素(E-cadherin)的表達(dá)、上調(diào)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá),以及增加ECM的聚集等。但生理表達(dá)量的TGF-β1是一種強(qiáng)效的免疫抑制和抗炎因子,能顯著抑制急性排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受,阻斷其表達(dá)并不明智。研究指出,過量表達(dá)的TGF-β1相當(dāng)一部分來自于T細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),通過抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)這一過程必然限制腎小管EMT進(jìn)展。
　　 血紅素加氧酶

4、-1(HO-1)被發(fā)現(xiàn)具有明確的抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)作用。其在體內(nèi)催化血紅素分解生成膽綠素、一氧化碳(carbonmonoxide,CO)和游離鐵,而CO在幾乎所有的損傷或疾病模型中部分甚至完全替代了HO-1所提供的保護(hù)作甩。因此,我們?cè)诖嘶A(chǔ)上推測(cè)CO在腎移植背景下對(duì)免疫細(xì)胞具有確切的抑制功能。進(jìn)一步推測(cè)CO對(duì)移植腎小管EMT可能有顯著的抑制或逆轉(zhuǎn)作用。
　　 目的：
　　 1.先期探索并優(yōu)化手術(shù)操作技術(shù),建立穩(wěn)定的DA-

5、WF大鼠移植腎動(dòng)物模型。
　　 2.在已建立的移植腎模型基礎(chǔ)上,通過相關(guān)染色檢驗(yàn)明確移植腎組織間質(zhì)纖維化的出現(xiàn),并證實(shí)移植腎臟中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的存在。
　　 3.應(yīng)用一氧化碳釋放分子CORM-2對(duì)DA-WF移植腎問質(zhì)纖維化模型進(jìn)行干預(yù),以獲取課題試驗(yàn)用組織標(biāo)本。
　　 4.通過對(duì)組織標(biāo)本的相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)一步研究CO是否通過抑制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)這一機(jī)制來抑制或逆轉(zhuǎn)移植腎EMT,進(jìn)而顯著延緩移植腎纖維化進(jìn)程。

6、>　　 方法：
　　 本課題分四部分進(jìn)行:
　　 1.利用SD大鼠探索并優(yōu)化同種異體腎移植手術(shù)操作技術(shù)。水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈直接插管原位灌注的方式處理供腎,以供、受體腎臟同名血管端端吻合、輸尿管端端吻合的方式移植腎臟,受體自體腎采用“腎血管體外延遲結(jié)扎”方式處理。
　　 2.DarkAgouti(DA)(RT1av1)大鼠為供體,Wistar-Furth(WF)(Rtlu)大鼠為受體建立同種異體腎移植(D

7、A-WF)模型并標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組,WF-WF大鼠腎移植做對(duì)照組。術(shù)前3d及術(shù)后2w內(nèi)WF受體大鼠接受10mg/kg/d的環(huán)孢素皮下注射。于術(shù)后第2w、4w、8w、12w測(cè)量大鼠體重并測(cè)血肌酐和尿素氮,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠一般情況和腎功能變化。取第12w實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組移植腎臟組織分別行H&E染色、Masson染色、E-cadherin免疫組化、α-SMA免疫組化。采用HPIAS-1000彩色病理圖像分析儀分析、SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。

8、>　　 3.建立DA-WF腎移植模型,隨機(jī)編號(hào)分為兩組,一組行CORM-2干預(yù),一組行iCORM-2干預(yù),WF-WF做空白參照。每組內(nèi)的大鼠選取固定數(shù)目在術(shù)后第2w、4w、8w、12w分別稱重并處死。留取處死受體大鼠移植‘腎組織及腔靜脈血。移植腎組織備行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),腔靜脈血檢測(cè)血肌酐、尿素氮指標(biāo)進(jìn)行分析。使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。
　　 4.將第2w、4w、8w、12w共四批次行CORM-2干預(yù),iCORM-2干預(yù)

9、及空白參照移的植腎組織標(biāo)本分別行H&E染色、Masson染色、E-cadherin免疫組化、α-SMA免疫組化、CD3免疫組化、CD163免疫組化。采用HPLAS-1000彩色病理圖像分析儀分析、SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過先期探索及練習(xí),基本掌握了建立大鼠腎移植模型的相關(guān)技術(shù),能基本保證模型的成活率。為課題實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)支持及相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。
　　 2.通過建立并對(duì)比DA-WF、W

10、F-WF兩組腎移植模型的術(shù)后一般狀況、移植腎功能比較及第12w移植腎組織的HE染色、Masson染色和移植腎組織的E-cadherin和α-SMA的免疫組化染色證實(shí)DA-WF大鼠腎移植模型誘導(dǎo)了慢性排斥反應(yīng),出現(xiàn)了腎臟間質(zhì)纖維化改變,并且證實(shí)了移植腎臟模型中EMT的存在。
　　 3.在對(duì)CORM-2干預(yù),iCORM-2干預(yù)、空白參照三組大鼠腎移植模型的移植腎功能的檢測(cè)結(jié)果分析中可以證實(shí)一氧化碳釋放分子CORM-2可以抑制移植腎臟