幽門螺桿菌適應(yīng)性蛋白的初步研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)作為唯一能在人體胃內(nèi)酸性環(huán)境中定植并長(zhǎng)期生存的致病菌，其生長(zhǎng)在體內(nèi)必然會(huì)受到各種不利條件的影響，H.pylori通過(guò)啟動(dòng)一系列的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)抵抗這些脅迫因素以達(dá)到保種生存并導(dǎo)致疾病的目的。形態(tài)學(xué)變化是H.pylori的適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制之一，在不同的脅迫條件下H.pylori可發(fā)生不同的形態(tài)學(xué)變化，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者，無(wú)論何種表征蛋白質(zhì)在其中將起重要作用，比較

2、蛋白質(zhì)組學(xué)是研究病原菌在各種脅迫因素下蛋白質(zhì)表達(dá)差異的理想工具，現(xiàn)今較普遍使用的技術(shù)體系包括雙向凝膠電泳，質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)分析。膽汁是機(jī)體重要的天然抗病原菌物質(zhì)，研究H.pylori在膽汁中的存活能力，對(duì)于揭示H.pylori感染與十二指腸潰瘍的發(fā)生規(guī)律有重要意義，為此我們研究了H.pylori在膽汁脅迫下的蛋白表達(dá)狀態(tài)。絲狀體是H.pylori除螺桿狀和球形體以外的一種成活形式，對(duì)絲狀體蛋白表達(dá)譜的研究，有助于揭示其發(fā)生規(guī)律。我們

3、曾發(fā)現(xiàn)鞭毛絲帽蛋白與H.pylori結(jié)構(gòu)性群體結(jié)構(gòu)形成密切相關(guān)，然而，對(duì)生物質(zhì)譜篩選的候選蛋白尚需作進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，為此，我們構(gòu)建了H.pylori結(jié)構(gòu)性群體形成相關(guān)蛋白鞭毛絲帽蛋白基因缺失突變株，為進(jìn)一步驗(yàn)證此蛋白的功能及闡明H.pylori結(jié)構(gòu)性群體的形成機(jī)制奠定工作基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容及研究結(jié)果如下： 一、膽汁對(duì)幽門螺桿菌的抑制及其蛋白質(zhì)表達(dá)譜的初步研究 膽汁脅迫是人體內(nèi)抑制H.pylori生長(zhǎng)的不利條件之一，許多

4、研究也表明膽汁能夠抑制H.pylori的生長(zhǎng)，但H.pylori仍能夠在膽汁豐富的十二指腸球部存在，而對(duì)其他肝膽系統(tǒng)的感染較少見(jiàn)，因此我們推測(cè)膽汁的酸化影響其對(duì)H.pylori的抑制活性。為了研究H.pylori對(duì)膽汁脅迫的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，我們首先篩選了膽汁及其酸化離心后對(duì)H.pylori的抑制作用，用掃描電鏡觀察了膽汁脅迫下H.pylori的形態(tài)學(xué)改變，并通過(guò)雙向凝膠電泳技術(shù)研究了膽汁脅迫后H.pylori的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，研究結(jié)果發(fā)

5、現(xiàn)膽汁酸化后對(duì)H.pylori的抑制活性降低，H.pylori在膽汁脅迫下部分由螺桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐误w結(jié)構(gòu)，通過(guò)2一DE圖譜配比找到13種差異性蛋白斑點(diǎn)，其中4種表達(dá)上升，2種表達(dá)降低，4種新表達(dá)的以及3種表達(dá)缺失的蛋白質(zhì)，在以后的工作中我們將利用生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定并對(duì)其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)新的致病因子及抗菌靶位。 二、幽門螺桿菌絲狀體對(duì)胃粘膜細(xì)胞粘附性及蛋白表達(dá)譜的初步研究 絲狀體的形成作為

6、H.pylori生命周期的一個(gè)時(shí)相，可能是該菌抗逆生存的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制之一，我們?cè)鴮?duì)絲狀體的可回復(fù)性及特異性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究其致病性及調(diào)控機(jī)制，我們首先利用胺曲南誘導(dǎo)出H.pylori絲狀體模型，然后運(yùn)用掃描電鏡觀察了H.pylori絲狀體對(duì)胃粘膜上皮細(xì)胞的粘附性及細(xì)胞發(fā)生的病理學(xué)改變，同時(shí)利用雙向凝膠電泳比較了H.pylori絲狀體和螺桿狀H.pylori的蛋白表達(dá)譜。掃描電鏡結(jié)果顯示，H.pylori絲狀體仍能特異性地粘附于

7、胃粘膜上皮細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞的微絨毛脫落、消失等病理學(xué)變化，說(shuō)明H.pylori絲狀體仍具備致病性。雙向電泳結(jié)果顯示H.pylori絲狀體的蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)4種蛋白表達(dá)上升，3種表達(dá)下降，3種完全被抑制以及1種新出現(xiàn)的蛋白質(zhì)。以上結(jié)果還需運(yùn)用生物質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)篩選的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定并通過(guò)功能基因組學(xué)方法明確其編碼基因的功能，闡明H.pylori絲狀體的適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制。 三、幽門螺桿菌鞭毛絲帽蛋白基因缺失突變株的構(gòu)建及鑒

8、定 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)鞭毛絲帽蛋白與H.pylori結(jié)構(gòu)性群體形成密切相關(guān)，該蛋白由FLiD基因編碼，參與鞭毛絲狀體遠(yuǎn)端的戴帽，使鞭毛蛋白單體組裝成鞭毛絲狀體，但其在H.pylori結(jié)構(gòu)性群體形成中的作用及其致病機(jī)理還未完全清楚。識(shí)別基因功能最可靠的方法是利用基因缺失技術(shù)構(gòu)建特定基因缺失的突變株，觀察特定基因表達(dá)剔除后細(xì)胞表型及功能的轉(zhuǎn)變。我們利用PCR方法擴(kuò)增FliD基因兩端的兩個(gè)目的基因片段作為同源重組的指導(dǎo)序列，自質(zhì)粒pU

9、Cl8一K2上酶切回收卡那霉素抗性基因，將以上三個(gè)片段共同插入pILL570載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出以卡那霉素及大關(guān)霉素為篩選標(biāo)志的突變載體，利用電穿孔法將此突變載體轉(zhuǎn)入H.pylori菌株，根據(jù)同源重組的原理篩選出fliD缺失的H.pylori突變株并經(jīng)PCR方法鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建了fliD基因缺失的突變載體，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的條帶與設(shè)計(jì)結(jié)果完全一致，PCR方法鑒定所篩選出的菌株為FliD基因缺失的H.pylori突變株，該結(jié)