DHPLC技術(shù)應(yīng)用于兩種常見(jiàn)出生缺陷的突變分析.pdf

1、所謂出生缺陷是指凡出生時(shí)就有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能的異常或代謝缺陷所致的異常。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式的改變,人類疾病譜和死亡譜發(fā)生了很大的變化,出生缺陷已逐漸成為我國(guó)圍生期嬰兒死亡的主要因?yàn)?。根?jù)衛(wèi)生部發(fā)布的出生缺陷監(jiān)測(cè)結(jié)果,全國(guó)出生缺陷總發(fā)生率約為11‰,約8000萬(wàn)殘疾人口中有70％是由出生缺陷所致。2004年田佩玲等對(duì)廣東省0～5歲兒童出生缺陷情況調(diào)查結(jié)果顯示,廣東地區(qū)最常見(jiàn)的出生缺陷為先天性心臟病,其次為地中海貧血。國(guó)內(nèi)大量研究表明,先

2、天性心臟病幾乎占據(jù)了主要出生缺陷疾病的1/3,是最常見(jiàn)的心臟病。該病是與環(huán)境因素相關(guān)的多基因遺傳病,其遺傳背景復(fù)雜,致病機(jī)制尚不明確。地中海貧血是最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一,地理分布廣泛,人群攜帶率高,是嚴(yán)重危害人類健康的溶血性疾病。先天性心臟病和地中海貧血位列我國(guó)南方地區(qū)主要出生缺陷的前五位,已成為影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神等方面的負(fù)擔(dān)。因此,建立行之有效的疾病篩查和診斷技術(shù)可及早

3、預(yù)防先天性心臟病和重癥地中海貧血的發(fā)生,以期降低此類疾病的發(fā)病率,對(duì)提高我國(guó)人口素質(zhì)具有重要意義。
　　 變性高效液相色譜(Denaturing High Performance Liquid Chromatography,DHPLC)技術(shù)已被證明是一種具有精確、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量、半自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)的用于檢測(cè)已知突變及篩查未知突變的方法。其敏感性和特異性可達(dá)96％～100％,明顯高于常用的變性梯度凝膠電泳(Denatured Gr

4、adient GelElectrophoresis,DGGE)、錯(cuò)配化學(xué)切割分析(Chemical Cleavage of Mismatch,CCM)、構(gòu)象敏感性凝膠電泳(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis,CSGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-Strand Conformation Polymorphisms,SSCP)等變異檢測(cè)技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的突變篩查和分子

5、診斷中。基于DHPLC上述特點(diǎn),本研究一方面試圖建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且適于中國(guó)人群常見(jiàn)非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病的基因分型技術(shù)；另一方面,擬進(jìn)行中國(guó)南方地區(qū)單純性先天性心臟病易感基因突變的研究。
　　 第一章:基于PCR/DHPLC技術(shù)的中國(guó)人群非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知突變快速基因分型
　　 目的:非缺失型α-地中海貧血,α-異常血紅蛋白病以及具備非缺失型α-地中海貧血特征的異常

6、血紅蛋白病是一組由α-珠蛋白基因點(diǎn)突變引起的遺傳性溶血性血紅蛋白病,目前已發(fā)現(xiàn)至少300種突變與該病有關(guān)。本研究擬建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的適于中國(guó)人群非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知致病突變的基因分型技術(shù),使之可以應(yīng)用于相關(guān)疾病的研究、臨床診斷及大規(guī)模分子流行病學(xué)的人群篩查工作中。
　　 設(shè)計(jì)和方法:所有樣品均來(lái)自我國(guó)南方地貧高發(fā)區(qū),采用標(biāo)準(zhǔn)的飽和酚/氯仿法從外周血中提取基因組DNA。首先,收集本教研室已測(cè)通α-

7、珠蛋白基因全長(zhǎng)的107例測(cè)序樣品作為群體研究資料分析α-珠蛋白基因上多態(tài)位點(diǎn)信息。其次,將33例包含10種致病突變和3種SNPs(來(lái)自群體資料)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)變異位點(diǎn)分布特征分別設(shè)計(jì)兩對(duì)擴(kuò)增大片段(885bp和765bp)引物和兩對(duì)擴(kuò)增小片段(295bp和277bp)引物,進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chainreaction,PCR),將標(biāo)準(zhǔn)品的PCR產(chǎn)物用于建立DHPLC檢測(cè)條件和與各種基因型對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)DHP

8、LC圖譜。另選取已測(cè)序和/或由反向點(diǎn)雜交技術(shù)確診(ReverseDot-Blot,RDB)的171例包含各種基因型的樣品作為盲法對(duì)照的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,用于評(píng)價(jià)本方法的準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果與討論:本研究通過(guò)33例標(biāo)準(zhǔn)品成功建立了非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知致病突變的PCR/DHPLC檢測(cè)體系和與由10種突變及3種SNPs組成的22種基因型對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)DHPLC圖譜。盲法實(shí)驗(yàn)中,171例由DHPLC方法檢測(cè)得出的結(jié)果與之前

9、檢測(cè)結(jié)果完全一致。
　　 本研究建立的基于PCR/DHPLC技術(shù)的非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病已知突變基因診斷方法是一種高通量、高靈敏度、自動(dòng)化、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)。該方法用于診斷中國(guó)人群常見(jiàn)非缺失型α-地貧,消除了目前廣泛應(yīng)用的RDB檢測(cè)方法中存在的假陽(yáng)性及假陰性問(wèn)題,并能用于非缺失型α-地貧未知突變的檢出。因此,該方法可適用于中國(guó)人群常見(jiàn)非缺失型α-地中海貧血和α-異常血紅蛋白病的產(chǎn)前診斷和大規(guī)模

10、的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
　　 第二章:基于PCR/DHPLC技術(shù)的中國(guó)南方單純性先天性心臟病易感基因突變熱點(diǎn)研究
　　 目的:先天性心臟病(Congenital Heart Disease,CHD)是胎兒時(shí)期心血管發(fā)育異常而導(dǎo)致的先天畸形,在新生兒非感染性死亡中占首位。僅表現(xiàn)為心臟畸形而不伴有其他系統(tǒng)的先天異常,稱之為單純性先天性心臟病(non-syndromicCHD)。CHD是與環(huán)境相關(guān)的,某顯性主基因參與的多基因

11、遺傳性疾病,其遺傳因素在疾病發(fā)生過(guò)程中存在明顯的地區(qū)差異和種族差異。融合遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)和生物化學(xué)等方法的研究發(fā)現(xiàn),心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在CHD的分子基礎(chǔ)中占據(jù)核心地位,轉(zhuǎn)錄因子基因突變成為目前先天性心臟病發(fā)病機(jī)制研究的焦點(diǎn)。最早發(fā)現(xiàn)的心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5基因在國(guó)外人群共發(fā)現(xiàn)29種突變,突變率約4％。國(guó)內(nèi),Li T等在一個(gè)房間隔缺損家系中發(fā)現(xiàn)NKX2.5基因3個(gè)錯(cuò)義突變,而散發(fā)型先心病中至今僅孫淼發(fā)現(xiàn)了一個(gè)三堿基缺失突變

12、。國(guó)外人群研究GATA4基因突變率僅為約2％,而中國(guó)漢族人群唐朝暉在31例患者中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的錯(cuò)義突變,Weimin Zhang等在486例散發(fā)患者的12例不相關(guān)個(gè)體中發(fā)現(xiàn)9種新突變,包括一個(gè)小缺失突變、兩個(gè)小插入突變和六個(gè)錯(cuò)義突變,提示中國(guó)漢族人群先天性心臟病患者轉(zhuǎn)錄因子基因突變檢測(cè)率及突變位點(diǎn)可能與國(guó)外人群不同。神經(jīng)嵴相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因TFAP2B與動(dòng)脈導(dǎo)管未閉發(fā)病呈強(qiáng)關(guān)聯(lián),國(guó)外研究在Char氏綜合征家系及單純動(dòng)脈導(dǎo)管未閉家系中發(fā)現(xiàn)8

13、種不同致病突變,而在中國(guó)人群未見(jiàn)報(bào)道。本課題擬研究GATA4、NKX2.5、TFAP2B基因在中國(guó)南方地區(qū)單純性先心病患者中的突變位點(diǎn)及分布情況,并進(jìn)一步分析基因型與表型間的關(guān)系。
　　 方法:收集224例單純性先天性心臟病患者和121例健康個(gè)體的外周靜脈血采用標(biāo)準(zhǔn)飽和酚/氯仿方法抽提基因組DNA,利用PCR反應(yīng)以擴(kuò)增GATA4、NKX2.5和TFAP2B基因的編碼序列為主,經(jīng)DHPLC技術(shù)直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),出現(xiàn)異常峰型

14、的樣本再經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證變異性質(zhì)。
　　 結(jié)果:1.GATA4基因中,在1例室間隔缺損病人發(fā)現(xiàn)一種新的錯(cuò)義突變,編碼鏈第778位堿基C轉(zhuǎn)換為堿基G(c.788 C>G),導(dǎo)致263位密碼子由GCC轉(zhuǎn)換為GGC,編碼的氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)換為甘氨酸(p.Ala263Gly),位于GATA4蛋白高度保守的氨基端鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)；發(fā)現(xiàn)3種未經(jīng)報(bào)道的同義突變,分別為c.531C>A(GCC>GCA,p.Ala177Ala),c.1308C>T(

15、CAC>CAT,p.His435His)和c.1326G>A(GCG>GCA,p.Ala422Ala)。這些突變?cè)趯?duì)照組中均未檢測(cè)到。
　　 2.NKX2.5基因中未檢測(cè)到致病突變,僅發(fā)現(xiàn)三種已報(bào)道的SNPs:rs2277963(c.63A>G,GAA>GAG,p.Glu21Glu),rs3729753(c.606G>C,CTG>CTCp.Leu202Leu)和rs703752(c.975-61 G>T),基因型頻率及等位基因頻

16、率與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的中國(guó)人群攜帶率無(wú)顯著性差異。
　　 3.首次在中國(guó)散發(fā)單純性先天性心臟病患者中發(fā)現(xiàn)2種新的TFAP2B基因突變。1例完全性心內(nèi)膜墊缺損患者攜帶c.31A>G(ATC>GTC,p.Ile11Val)錯(cuò)義突變,正常人群中未檢測(cè)到該突變。病例組中另有6例表型不一的無(wú)關(guān)個(gè)體攜帶有同一種錯(cuò)義突變c.1006 G>A(GTC>ATC,p.Val336Ile),在正常人群中也被檢測(cè)到,攜帶率為3/121。
　

17、　 結(jié)論:1.GATA4基因錯(cuò)義突變c.788 C>G可能是中國(guó)南方人群室間隔缺損的發(fā)病因?yàn)橹?。突變p.Ala263Gly使轉(zhuǎn)錄因子GATA4氨基端保守的鋅指結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變,干擾室間隔正常的發(fā)生與發(fā)育從而導(dǎo)致缺損的發(fā)生。GATA4基因可能在心臟間隔的正常發(fā)育中起著重要作用。2.中國(guó)南方單純性CHD患者中NKX2.5基因突變發(fā)生率極低,突變的發(fā)現(xiàn)可能限于某些家系或一些帶有特殊表型的個(gè)體中。NKX2.5基因?qū)ξ覈?guó)南方地區(qū)先心病的致病作用