RNA干擾SNCG基因表達對乳腺癌MCF-7細胞的放射敏感性的影響.pdf

1、背景
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是美國婦女最常見并且第二大癌癥死亡的原因。在我國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升的趨勢，嚴重影響著婦女的身心健康甚至危及生命。乳腺癌傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、化療和放療。經(jīng)研究，40％-60％的乳腺癌患者需要接受放療。乳腺癌細胞對放射治療具有中度敏感性，然而患者的生存率并未得到明顯提高，并會出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能。腫瘤的基因-放射治療是近年提出治療腫瘤的新思路，本研究中將基因治療與放射治

2、療有機結(jié)合，旨在研究基因治療對乳腺癌放射治療的增敏作用，并探討其機制。
　　SNCG(γ-synuclein)基因最早的研究發(fā)現(xiàn)于人類乳腺癌cDNA文庫[1]，其在進展期乳腺癌中呈現(xiàn)特異性表達，因此被稱為乳腺癌特異性基因1(BCSG1)。SNCG基因位于染色體10q23，編碼一條包含123個氨基酸的蛋白質(zhì)[2]。研究表明，野生型SNCG基因在癌癥中的蛋白過表達可能與惡性程度相關(guān)[3]。SNCG的過度表達使其協(xié)助細胞躲避有絲分裂檢查

3、點，導致細胞產(chǎn)生非整倍體的增殖。SNCG基因序列研究發(fā)現(xiàn)，SNCG在腫瘤細胞系的過表達主要是因為轉(zhuǎn)錄的被激活，而并非基因的擴增或突變[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)SNCG在乳腺癌[5]、子宮癌[6]、前列腺癌[7]、胰腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等眾多惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，其異常表達與腫瘤的分級和惡性進展密切相關(guān)。SNCG過度表達會刺激乳腺癌細胞的增殖和誘導轉(zhuǎn)移[10]，可作為乳腺癌的獨立不良預后因素[11]，有望成為乳腺癌分子治療的靶點。

4、　　本實驗通過脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法將shRNA導入乳腺癌MCF-7細胞中，下調(diào)SNCG基因的表達，并建立SNCG低表達的MCF-7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。將各組細胞聯(lián)合不同劑量的X線照射，觀察SNCG基因下調(diào)對乳腺癌細胞凋亡及放射敏感性的影響。
　　目的
　　研究RNA干擾對SNCG基因mRNA及蛋白水平的影響，以及SNCG-shRNA聯(lián)合不同劑量的X線照射對乳腺癌細胞凋亡及放射敏感性的影響，探討SNCG基因下調(diào)對乳腺癌細胞放療增敏

5、作用的可能機制。
　　材料與方法
　　1針對已知SNCG基因的cDNA序列，設計并合成4條特異性干擾序列(SNCG-shRNA-1、SNCG-shRNA-2、SNCG-shRNA-3、SNCG-shRNA-4)和1條非特異性序列(SNCG-shNC)。
　　2利用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)將shRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細胞，通過半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白印跡技術(shù)(Westernblot)檢測SNCG

6、基因被干擾后在mRNA及蛋白水平的表達變化。
　　3通過克隆形成實驗觀察SNCG-shRNA對乳腺癌細胞放射敏感性的影響。
　　4通過流式細胞術(shù)檢測SNCG-shRNA轉(zhuǎn)染細胞聯(lián)合X線照射對細胞凋亡的影響。
　　5統(tǒng)計學方法:采用SPSS17.0軟件分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，對定量資料進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果
　　1脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)可將SNC

7、G-shRNA成功轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細胞。
　　2RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示SNCG-shRNA轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細胞后，SNCG基因在mRNA及蛋白水平的表達均明顯降低(P＜0.05)。
　　3克隆形成實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陽性組細胞的存活分數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染陰性組和空白對照組，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時，各組細胞的存活分數(shù)隨照射劑量的增加而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。
　　4流式細胞術(shù)結(jié)