人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中microRNA介導(dǎo)的NF-κB信號通路調(diào)節(jié).pdf

1、目的:前期，我們實驗室已經(jīng)確證了建立一定的共培養(yǎng)條件可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞。但其中關(guān)鍵的基礎(chǔ)科學(xué)問題并沒有完全解決，本研究的主要目的是，利用microRNA新技術(shù)，尋找MSCs分化為汗腺樣細(xì)胞過程中的關(guān)鍵microRNA及其介導(dǎo)的信號通路調(diào)控，并驗證microRNA細(xì)胞生物功能。
　　方法:前期研究表明，EDA-A1能促進(jìn)正常和外胚層發(fā)育缺陷小鼠的汗腺、毛囊等外胚層組織器官的發(fā)育，EGF能提高M(jìn)SCs分化為SGLC

2、s的誘導(dǎo)率。因此，本文采用1μg/ml EDA-A1、50 ng/ml EGF以及汗腺熱休克損傷微環(huán)境，通過transwell間接培養(yǎng)板，誘導(dǎo)MSCs分化為SGLCs。然后通過microRNA基因芯片檢測，分析MSCs誘導(dǎo)前后，以及正常汗腺的microRNA差異表達(dá)譜，其中發(fā)生極其顯著改變的microRNAs被篩選出來，通過生物信息學(xué)進(jìn)行靶點預(yù)測，其中直接靶向與汗腺發(fā)育、干細(xì)胞分化相關(guān)基因的microRNAs: has-miR-138-

3、5p和has-miR-146a-5p被進(jìn)一步篩選出來。利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑分別將synthetic has-miR-138-5p mimics(inhibitor)-cy3、 synthetic has-miR-146a-5p mimics(irhibitor)-cy3和 syntheticmicroRNA mimics(inhibitor) negative control-cy3轉(zhuǎn)染MSCs，進(jìn)行靶基因驗證，分析其參與的信號通

4、路網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步驗證其生物功能。
　　結(jié)果:通過間接誘導(dǎo)模型，誘導(dǎo)10d后，transwell培養(yǎng)板上層的MSCs，部分形態(tài)由“長梭形”變?yōu)椤安灰?guī)則橢圓形或多邊形”，局部呈現(xiàn)“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示大部分誘導(dǎo)后的細(xì)胞CEA、CK19、CK7、CK8和CK14表達(dá)陽性，說明部分細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后表型轉(zhuǎn)換為汗腺樣細(xì)胞。
　　MicroRNA表達(dá)譜的差異比對結(jié)果顯示，SGLCs VS MSCs，19 microRNA

5、s上調(diào)，49 microRNAs下調(diào);SGCs VS MSCs，120 microRNAs上調(diào)，59 microRNAs下調(diào)。為了縮小研究范圍，我們?nèi)GLCs VS MSCs和SGCs VS MSCs的交集，結(jié)果37 microRNAs在以上兩個比對中均出現(xiàn)，其中12 microRNAs上調(diào)，25 microRNAs下調(diào)。通過生物信息學(xué)靶點預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)該37個microRNAs與汗腺發(fā)育和干細(xì)胞分化的一系列因子相關(guān)，例如靶向細(xì)胞因子

6、CEA、KRT、EDA以及參與信號通路EDA/EDAR、 NF-κB、 Wnt、 ERK等的調(diào)節(jié)。其中has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p均直接靶向NF-κB信號通路相關(guān)的多個基因。
　　MicroRNAs轉(zhuǎn)染MSCs48 h后，熒光顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞胞漿顯示飽和的紅色熒光，流式結(jié)果亦顯示轉(zhuǎn)染效率為98.56％。RT-PCR結(jié)果顯示，has-miR-138-5p抑制劑轉(zhuǎn)染MSCs48 h后，h-KRT

7、19、h-NFKB1、h-RELA和h-RELB的表達(dá)顯著增高，但轉(zhuǎn)染前后均不表達(dá)h-KRT16，has-miR-138-5p模擬物轉(zhuǎn)染MSCs后，h-NFKB1、h-RELA和h-RELB表達(dá)顯著降低。另，has-miR-146a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染MSCs后，h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達(dá)增高，has-miR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染MSCs后，h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達(dá)降低。
　　報道

8、顯示，miR-146是NF-kB通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)者，表達(dá)miR-146a的細(xì)胞，其IκBα的絲氨酸32位置的磷酸化將降低至～40％。因此，我們推斷，MSCs誘導(dǎo)過程中，has-miR-138-5p減少，導(dǎo)致其調(diào)節(jié)的靶基因h-NFKB1、h-RELA、h-RELB表達(dá)增加，從而激活NF-κB信號通路，這時，作為一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，has-miR-146a-5p表達(dá)增加，導(dǎo)致h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達(dá)降低，從而從上游