苦馬豆素單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、免疫分析技術(shù)(Immunoassay，IA)是以抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、檢測迅速和成本低廉等特點(diǎn)，在藥物、毒素分析和環(huán)境污染物檢測等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。抗體作為各種免疫分析的核心試劑，對免疫分析的靈敏度、特異性等起著至關(guān)重要的作用。單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)是由單個細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群所產(chǎn)生的抗體，只針對抗原的某一決定簇有特異性免疫反應(yīng)，其性質(zhì)純、效價高、特

2、異性強(qiáng)，可以避免血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，且檢測低限可達(dá)納克或皮克水平。大多數(shù)藥物、毒素和環(huán)境污染物的分子質(zhì)量小于1000 u，屬于半抗原，可與其特異性抗體結(jié)合形成半抗原-抗體復(fù)合物，但是其本身不具有免疫原性，用此類半抗原與大分子質(zhì)量載體偶聯(lián)制備成人工免疫原免疫動物，用雜交瘤細(xì)胞制備技術(shù)制備針對半抗原的特異性單克隆抗體，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)等許多研究領(lǐng)域，顯示出巨大的應(yīng)用價值和潛力。 瘋草的主要有毒成分--苦馬豆素(swains

3、onine，SW)，分子量小(173)，屬于半抗原，將其與大分子載體化學(xué)合成為免疫原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，使免疫學(xué)檢測SW和免疫學(xué)防治家畜瘋草中毒成為現(xiàn)實(shí)。本研究擬用人工合成抗原SW-HSA免疫Balb/C小鼠，達(dá)到一定效價后取脾臟制備免疫脾細(xì)胞，利用單克隆抗體技術(shù)制備分泌SW特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步制備出SW單克隆抗體，為免疫學(xué)檢測SW和免疫學(xué)防治家畜瘋草中毒奠定基礎(chǔ)，研究取得如下結(jié)果。 1 將合成的SW-HSA抗

4、原免疫4只Balb/c小鼠，共免疫4次，間接ELISA測定小鼠血清中SW抗體。結(jié)果表明，第3次免疫后，測定各小鼠血清中抗體效價分別為2<'7>、2<'6>、2<'6>、2<'6>，第4次免疫后，抗體效價分別為2<'9>、2<'8>、2<'8>、2<'8>，試驗(yàn)獲得了抗體效價較高的免疫小鼠。 2 無菌采取免疫小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行了3次融合，其中第1次融合率較高，為36.7％。 3 間接EIASA檢測有

5、克隆孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體效價，篩選陽性孔細(xì)胞，第1次融合的細(xì)胞陽性率較高，為7.095％。 4 陽性孔的細(xì)胞經(jīng)3次單克隆培養(yǎng)后，獲得了1株生長穩(wěn)定、能大量分泌抗SW單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體效價為2<'6>，命名為 1C3。 5 用秋水仙素阻抑法對雜交瘤細(xì)胞的核型進(jìn)行了分析，1C3 株細(xì)胞染色體數(shù)目為45～50對之間，接近2種親本細(xì)胞染色體數(shù)目總和，證明確為兩種親本細(xì)胞融合后的雜交體。 6 Balb/

6、c小鼠腹腔注射1C3株雜交瘤細(xì)胞，收集腹水，EIASA測定腹水中SW抗體效價為2<'11>。 7 硫酸銨沉淀法將3 mL腹水進(jìn)行單克隆抗體的粗提，得到的粗提物溶液用抽真空冷凍干燥。SDS-PAGE凝膠電泳分析粗提單抗的組分，可見主要呈現(xiàn)兩條帶，分子量約為55 ku和26 ku，分別與抗體的重、輕鏈分子量大小一致。 8 間接ELISA測定單克隆抗體相對親和力，以被檢單克隆抗體的不同濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的OD<,490nm>