殼聚糖-膠原-PEEK-HA支架負載骨髓間充質(zhì)干細胞誘導成軟骨細胞的實驗研究.pdf

1、目的：研究雙層殼聚糖-膠原/聚醚醚酮-羥基磷灰石支架的制作方法；支架負載骨髓間充質(zhì)干細胞，定向誘導成軟骨細胞表型，探討CS-COL/PEEK-HA支架作為軟骨組織工程支架的可行性。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)及鑒定：無菌胸骨穿刺針從脛骨近段采取日本大耳白兔的骨髓約5ml，全骨髓培養(yǎng)法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells.BMSCs），10％胎牛血清的LG-DMEM作為細胞

2、培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5％的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周換液兩次。取第3代BMSCs，免疫細胞化學測定其細胞表面抗原CD44、CD45，以用作對BMSCs的初步鑒定。
　　 2.殼聚糖-膠原/聚醚醚酮-羥基磷灰石支架制作：首先將PEEK和HA粉末按照70/30質(zhì)量比混勻，在激光選區(qū)燒結(jié)機上設(shè)計樣品直徑為5mm，厚度為3mm的圓柱形支架，通過設(shè)置燒結(jié)參數(shù)制作出PEEK-HA支架，將支架放入72孔板（模具）內(nèi)，取3％的殼聚

3、糖和2％的膠原混合的醋酸溶液傾注入模具中的PEEK-HA支架上，-20℃預冷凍10h，凍干機中冷凍抽干24h制作成雙層CS-COL/PEEK-HA復合支架，傅立葉紅外光譜、掃描電鏡、液體置換法測定其理化性質(zhì)。
　　 3.以BMSCs為種子細胞，以CS-COL/PEEK-HA為支架，構(gòu)建細胞/支架復合體。將細胞/支架共同培養(yǎng)48小時后，電鏡觀察細胞在支架上的分布、黏附及生長情況。設(shè)置實驗組A（6例）和對照組B（6例），A組用含轉(zhuǎn)化

4、生長因子-β1、地塞米松、維生素C和含有15％胎牛血清的HG-DMEM培養(yǎng)基定向誘導，對照組用LG-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。2周后觀察實驗組細胞成軟骨細胞表型和對照組細胞生長情況，并進行免疫組織化學及生物學的相關(guān)檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.細胞形態(tài)學觀察及鑒定：細胞在10-14天呈克隆樣生長，細胞呈紡錘狀、成纖維樣。14天后取第3代細胞作CD44免疫細胞化學檢測可見陽性細胞主要集中在細胞密度高的區(qū)域，胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，

5、細胞周圍也出現(xiàn)黃染區(qū)，CD45檢測結(jié)果為陰性。
　　 2.CS-COL/PEEK-HA支架的理化性質(zhì)：CS-COL軟骨層樣支架孔徑為160-380 μ m，平均為270 μ m左右，孔相通性好，支架孔隙率為（76±5.01％）。PEEK-HA支架孔徑為100-300μ m，平均為200 μ m左右，孔相通性好，支架孔隙率為（65±4.18％）。傅立葉紅外光譜儀測定的數(shù)據(jù)表明復合支架組成物有典型的殼聚糖、膠原峰，沒有發(fā)現(xiàn)有聚乙二醇

6、峰。軟骨下骨層樣支架組成物有典型的PEEK、HA峰。
　　 3.電鏡觀察和免疫組織化學檢測：
　　 BMSCs與CS-COL/PEEK-HA支架共培養(yǎng)48小時后可見多孔支架表面密布細胞，部分細胞己滲入支架孔內(nèi)呈簇生長，底層細胞已呈梭形黏附在支架上，生長較好。實驗組經(jīng)定向誘導2周后可見細胞形態(tài)由長梭形向多邊形、多角形、不規(guī)則形轉(zhuǎn)化，細胞體積增大變?yōu)闄E圓形、圓形，此時細胞胞漿豐富，并分泌大量基質(zhì)，部分細胞出現(xiàn)突起向外伸展黏附