頭孢曲松改善血管性癡呆小鼠學習記憶功能及其機制.pdf

1、背景和目的：血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)嚴重影響患者的身心健康和生存質(zhì)量。谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，發(fā)揮重要的生理作用。但過量的谷氨酸對神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮性毒性作用，可導致神經(jīng)元死亡，是引發(fā)VD的重要機制之一。膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1（glial glutamate transporter GLT-1）在終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞、維持細胞外液谷氨酸濃度處于低水平、防止其興奮性毒性作用方面發(fā)揮

2、重要的作用。通過調(diào)制GLT-1、增強其攝取細胞外液谷氨酸的能力有可能成為治療血管性癡呆的新思路。
　　 β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松(Ceftriaxone，Cef)可以特異性的上調(diào)GLT-1的表達及其對谷氨酸的攝取，降低細胞外液中谷氨酸濃度及其興奮性毒性作用，從而發(fā)揮抗局灶性及全腦缺血性腦損傷作用、以及抗神經(jīng)病理性痛和痛過敏作用。據(jù)此，我們推測Cef可能會具有抗VD的作用。為證實這一設(shè)想，本研究觀察Cef對VD小鼠學習記憶能力、

3、海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)、以及GLT-1表達的變化，探討Cef在預防和治療VD中的作用、和GLT-1在VD發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床上預防和治療VD提供新線索和依據(jù)。
　　 方法：健康雄性老齡（9-10月齡）C57BL/6小鼠70只，體重30±5克，隨機分為以下5組:
　　 正常對照組(n=10):正常動物，不作任何處理，直接測定其學習記憶能力、觀察海馬組織學改變和GLT-1的表達。
　　 Sham組(n=10):給動物

4、進行VD的sham手術(shù)，于術(shù)后29天測定其學習記憶能力、觀察海馬組織學改變和GLT-1的表達。
　　 VD模型組(n=10):給動物進行VD造模手術(shù)，其它同sham組。
　　 Cef預防(Cefprevention)組(n=20):首先給動物腹腔注射Cef(200mg/kg)，每日1次，連續(xù)7天。末次注射后1天給動物進行VD造模手術(shù)。其它同sham組。同時設(shè)NS對照組(n=10)。
　　 Cef治療（Cefthe

5、rapy）組(n=20):首先給動物進行VD造模手術(shù)。于手術(shù)后第二天開始腹腔注射Cef(200mg/kg)，每日1次，連續(xù)7天。其它同sham組。同時設(shè)NS對照組(n=10)。
　　 以重復阻斷小鼠雙側(cè)頸總動脈血流法制作VD模型，每次阻斷20min，間隔10min，重復3次。采用Morris水迷宮實驗測定動物的學習記憶能力。應用硫堇染色法觀察動物海馬組織學變化，依據(jù)Kitagawa和Kato的分級方法(Histologicalg

6、rade，HG)對海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回(dentategyrusDG)區(qū)進行組織病理學評價，標準如下:0級，無神經(jīng)元死亡;Ⅰ級，散在神經(jīng)元死亡;Ⅱ級，成片神經(jīng)元死亡;Ⅲ級幾乎全部神經(jīng)元死亡。應用免疫組化技術(shù)觀察海馬GLT-1的表達情況。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，應用單因素方差分析(One-WayANOVA)、重復測量分析（Repeated-Measures法）和秩和檢驗（Kruskal-Wallis法）進行數(shù)據(jù)

7、分析，以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準。
　　 結(jié)果：
　　 1、水迷宮實驗
　　 隨著訓練次數(shù)的增加，正常對照組動物的尋臺潛伏期逐漸縮短，第十次訓練時縮短為25.7±13.1(sec)。Sham組動物的尋臺潛伏期的變化趨勢與正常對照組相比無明顯差別(P＞0.05)。VD模型組動物的尋臺潛伏期較Sham組和正常對照組顯著延長(P＜0.05)。Cef預防組動物的尋臺潛伏期較VD模型組明顯縮短(P＜0.05)，

8、接近sham組。治療組動物的尋臺潛伏期與VD模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 空間記憶保持能力測定顯示，正常對照組和Sham組動物在目標象限滯留時間比例無明顯差別(P＞0.05)。VD模型組動物較正常對照組和Sham組動物顯著縮短(P＜0.05)。Cef預防組動物在目標象限的滯留時間較VD模型組動物顯著升高(P＜0.05)，接近sham組水平。治療組動物在目標象限的滯留時間與VD模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。

9、
　　 2、海馬組織病理學評價
　　 正常對照組動物海馬CA1區(qū)輪廓清晰，錐體細胞為3-5層，細胞排列規(guī)則緊密，形狀呈圓形或橢圓形，組織學分級(Histologicalgrade，HG)以0-Ⅰ級為主，0級動物占90％。Sham組動物海馬組織病理學改變與正常對照組動物類似。VD模型組動物海馬錐體細胞層數(shù)減少，排列松散，細胞數(shù)目減少，細胞形態(tài)不規(guī)則，有核固縮現(xiàn)象，部分區(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)元大面積缺失，僅有少量細胞存活;與正常對照和

10、Sham組相比，其HG顯著升高（P＜0.05），表現(xiàn)為0級動物比例降低至20％，Ⅰ級動物升至40％，并且出現(xiàn)2級和3級動物，比例均達到20％。Cef預防組小鼠海馬錐體細胞排列較整齊，層次較清晰，細胞形態(tài)基本正常，無明顯核固縮現(xiàn)象發(fā)生;與VD模型組相比，其HG顯著下降(P＜0.05)，表現(xiàn)為0級比例升高，達到70％，其余30％的動物為Ⅰ級，無Ⅱ和Ⅲ級動物。與VD模型組相比，Cef治療組海馬CA1區(qū)組織學特征無明顯變化。
　　 海馬

11、CA3區(qū)和齒狀回的組織病理學變化趨勢與海馬CA1區(qū)相類似。
　　 3、GLT-1表達
　　 在正常對照組和Sham組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元層及其周邊區(qū)域均可見棕黃色GLT-1的免疫反應顆粒，染色均勻。VD模型組GLT-1免疫反應性顯著下降，染色較淺，積分光密度值明顯降低，表明缺血再灌注損傷下調(diào)了GLT-1的表達。與VD模型組相比，Cef預防組GLT-1的免疫反應性顯著增強，染色加深，積分光密度值較VD模型組有顯著升高(P

12、＜0.05)，表明Cef可以上調(diào)GLT-1的表達，并抑制缺血-再灌注損傷引起的GLT-1表達的下降。Cef治療組GLT-1的免疫反應性亦顯著增強，染色加深，積分光密度值較VD模型組有顯著升高(P＜0.05)，但升高幅度低于Cef預防組。生理鹽水對照組GLT-1的表達同VD模型組相比無明顯變化。
　　 海馬CA3區(qū)和齒狀回GLT-1表達的變化趨勢與CA1區(qū)相類似。
　　 結(jié)論:
　　 1、多次結(jié)扎松開雙側(cè)頸總動脈致

13、大腦缺血-再灌注的方法可使老齡C57BL/6小鼠空間學習獲得能力和空間記憶保持能力顯著下降，此方法可以作為VD動物模型的制作方法。
　　 2、VD模型組小鼠海馬各區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡和GLT-1表達下調(diào)。這些變化可能是導致其學習記憶能力下降的原因。
　　 3、預防性應用Cef可以減輕缺血-再灌注引起的認知障礙、海馬各區(qū)神經(jīng)元死亡和GLT-1表達下降。
　　 4、上述結(jié)果提示，Cef可通過上調(diào)GLT-1的表達減輕