江蘇地區(qū)斑潛蠅發(fā)生危害及三葉斑潛蠅HSP70家族基因克隆與表達.pdf

1、斑潛蠅屬Liriomyza隸屬于雙翅目Diptera、潛蠅科Agromyzidae、植潛蠅亞科Phytomyzidae。斑潛蠅種類繁多，種間競爭與替代迅速，不斷向世界各地蔓延危害。三葉斑潛蠅Liriomyza trifolii，美洲斑潛蠅Liriomyza sativae和南美斑潛蠅Liriomyza huidobrensis是入侵我國危害嚴(yán)重的三種多食性斑潛蠅。近年的調(diào)查顯示，在江蘇地區(qū)發(fā)生危害的主要是美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅，未發(fā)現(xiàn)南

2、美斑潛蠅的危害。此外，物種對溫度脅迫的耐受能力與其它因素一起決定它們的生存、分布、競爭和擴散。熱激蛋白被認(rèn)為是與昆蟲溫度耐受性關(guān)系最密切的一類蛋白質(zhì)，其中熱激蛋白70(HSP70)家族與溫度脅迫的關(guān)系最為密切，而有關(guān)三葉斑潛蠅的HSP70研究甚少。本研究于2014-2016年對江蘇地區(qū)斑潛蠅發(fā)生危害情況進行了調(diào)查;同時克隆了三葉斑潛蠅的4條HSP70基因，并對其表達模式進行了研究，同時還與其近緣斑潛蠅種類的HSP70基因進行比較，從分子

3、水平上揭示其抗逆境和生態(tài)適應(yīng)能力，為闡明其入侵及成災(zāi)機制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、2014-2016年連續(xù)三年對江蘇地區(qū)斑潛蠅的發(fā)生危害進行了調(diào)查，結(jié)果表明:江蘇地區(qū)主要發(fā)生危害的是美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅，且美洲斑潛蠅主要在蘇北地區(qū)發(fā)生危害，三葉斑潛蠅主要在蘇南蘇中地區(qū)發(fā)生危害，兩種斑潛蠅共同發(fā)生危害的區(qū)域主要集中在蘇中和沿江的部分地區(qū)。此外，不論在寄主種類、危害程度還是危害面積上，三葉斑潛蠅較美洲斑潛蠅具有更大的

4、競爭優(yōu)勢，而且揚州地區(qū)三葉斑潛蠅基本取代美洲斑潛蠅，成為該地區(qū)蔬菜上的優(yōu)勢種斑潛蠅，同時三葉斑潛蠅在揚州地區(qū)全年有3個發(fā)生危害高峰，其中8月上中旬的種群數(shù)量最大。
　　2、采用RT-PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)，從三葉斑潛蠅中克隆得到4條HSP70基因，分別為Lthsc70、Lthsp701、Lthsp702和Lthsp703。4條熱激蛋白基因cDNA序列全長分別為233

5、2、2261、2078和2296 bp，開放閱讀框長度分別為1956、1938、1899和1923 bp，分別編碼651、645、632和640個氨基酸，同時這4個熱激蛋白都具有HSP70家族的典型結(jié)構(gòu)域。序列分析發(fā)現(xiàn)，這4條Lthsp70s與其它物種的hsp70具有很高的相似性，并在系統(tǒng)進化樹上被歸為兩類。通過比對基因組序列和cDNA序列發(fā)現(xiàn)，Lthsp701、Lthsp702和Lthsp703均不含有內(nèi)含子，而Lthsc70含有1個

6、內(nèi)含子，長度為1273bp，內(nèi)含子的基因組剪切位點符合經(jīng)典的GT-AG規(guī)則。
　　3、通過RT-PCR技術(shù)克隆了9條三葉斑潛蠅內(nèi)參基因片段，包括ACTIN，18S，TUB，AK，EF-1，CAD，RPL32，GAPDH和H3。利用qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)技術(shù)研究了三葉斑潛蠅9條內(nèi)參基因在不同實驗條件下的穩(wěn)定性，運用常用的內(nèi)參基因篩選程序(NormFinder、geNorm和BestKe

7、eper)以及比較ΔCt法對各內(nèi)參基因進行了排名，最后使用RefFinder網(wǎng)頁程序進行綜合評估，得出最佳的內(nèi)參基因方案。最合適的內(nèi)參基因組合如下:不同發(fā)育階段為ACTIN和18S;性別為TUB和18S;高溫脅迫為ACTIN和GAPDH;低溫脅迫為ACTIN和18S。最后，利用目的基因Lthsp21.7對篩選的內(nèi)參基因進行驗證，結(jié)果表明內(nèi)參基因的篩選對目的基因定量標(biāo)準(zhǔn)化研究非常必須。
　　4、采用qRT-PCR技術(shù)研究了三葉斑潛蠅

8、4條hsp70s在高低溫脅迫和不同發(fā)育階段條件下的表達情況。結(jié)果表明高低溫脅迫都能誘導(dǎo)Lthsp70s的表達，但表達情況各不相同。Lthsc70和Lthsp702對溫度脅迫不敏感其表達量最高時的溫度(Tmax)的表達倍數(shù)與對照組相比顯著比Lthsp701和Lthsp703低;4條hsp70s在三葉斑潛蠅各發(fā)育階段中均能表達，Lthsc70和Lthsp702在各發(fā)育階段中表達差異顯著，Lthsc70在雌成蟲中的表達量最高，Lthsp702