小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)分析與優(yōu)化.pdf

1、小球藻(Chlorella)是一種單細(xì)胞微藻,含有豐富的蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素、多糖、維生素和小球藻生長(zhǎng)因子等多種營(yíng)養(yǎng)及活性成份,具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力和預(yù)防心血管疾病等生理功能.由于富含葉黃素(lutein),小球藻作為一種極具潛力的葉黃素源而受到關(guān)注.與其它葉黃素源相比,小球藻具有生長(zhǎng)迅速、可進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì).但迄今為止,小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)效率和水平與其它微生物(如酵母等)培養(yǎng)體系相比還有很大的差距.為建立高效的小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)系

2、統(tǒng)及葉黃素生產(chǎn)方式,本論文進(jìn)行了以下方面的研究工作: (1) 通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)對(duì)影響小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)和葉黃素合成的主要培養(yǎng)參數(shù),包括接種量、通氣量及培養(yǎng)基中四種主要成分--葡萄糖、KNO<,3>、KH<,2和MgSO<,4>的濃度進(jìn)行了研究和優(yōu)化,并在均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了多元回歸模型.研究結(jié)果表明,充足的通氣量是小球藻生長(zhǎng)和葉黃素合成的必要條件;葡萄糖濃度和c∶N比是影響小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)和葉黃素合成的主要因素,在10

3、-0g/l范圍內(nèi),較高的葡萄糖起始濃度可提高小球藻的最終生物量和葉黃素產(chǎn)量,但抑制小球藻的生長(zhǎng)速度;在2∶1-12∶1范圍內(nèi),較低的C∶N比有利于提高小球藻細(xì)胞中葉黃素含量. (2) 在對(duì)小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析的基礎(chǔ)上,通過(guò)流加方式的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了小球藻的高密度培養(yǎng).首先基于在 19-1 發(fā)酵罐中進(jìn)行的分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),構(gòu)建了描述小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的確定化模型 (deterministicmodel),在該模型的基礎(chǔ)上通過(guò)采用遺傳算法

4、進(jìn)行了流加方式的初步優(yōu)化,使小球藻的細(xì)胞濃度(以單位體積干重計(jì))和最大生產(chǎn)效率分別達(dá)到104.9g/l和0.613 g/l/h.在進(jìn)行多批流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了推廣性能更好的混合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,并對(duì)流加方式進(jìn)行了再次優(yōu)化,使小球藻的細(xì)胞濃度和最大生產(chǎn)效率分別達(dá)到116.2g/l和1.020g/l/h,分別為分批培養(yǎng)中的5.8倍和4倍,高于目前已報(bào)道的最高水平. (3)通過(guò)對(duì)前期建立的動(dòng)力學(xué)模型的比較分析,結(jié)合新獲得的研究結(jié)果

5、,構(gòu)建了小球藻異養(yǎng)合成葉黃素的動(dòng)力學(xué)模型.該模型能夠較好地描述不同條件下分批和流加培養(yǎng)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,具有良好的通用性能.基于該模型的分析結(jié)果表明:培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度在5-24g/l之間,硝酸鉀濃度在0.7-12g/l之間有利于小球藻的葉黃素合成.通過(guò)對(duì)流加培養(yǎng)的優(yōu)化,葉黃素的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率分別達(dá)到249.4 mg/l和1.65 mg/1/h,為分批培養(yǎng)中的5.9和4.2倍,高于目前己報(bào)道的最高水平. (4)根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和本

6、實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果,初步構(gòu)建了小球藻異養(yǎng)合成葉黃素的代謝網(wǎng)絡(luò).通過(guò)代謝流分析(metabolic nuX analysis,MFA)發(fā)現(xiàn),在關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)乙酰輔酶A處,絕大部分代謝流量進(jìn)入了與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的三羧酸循環(huán)和結(jié)構(gòu)大分子物質(zhì)的合成途徑,乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)的剛性可能是造成小球藻細(xì)胞中葉黃素含量難以提高的主要原因.極端代謝流分析的結(jié)果表明,葉黃素對(duì)葡萄糖的最高理論得率遠(yuǎn)高于目前的實(shí)際得率,顯示在小球藻異養(yǎng)合成葉黃素的得率方面還有很大的優(yōu)

7、化提高空間.根據(jù)關(guān)于類胡蘿卜素合成代謝的文獻(xiàn)報(bào)道和本研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,構(gòu)建了小球藻中類胡蘿卜素合成代謝的生化系統(tǒng)理論(biochemieal system theorem,BST)模型,在此基礎(chǔ)上分析了培養(yǎng)過(guò)程中小球藻比生長(zhǎng)速率對(duì)細(xì)胞中幾種類胡蘿卜素之間比例和葉黃素含量的影響,并通過(guò)模擬計(jì)算探討了提高細(xì)胞葉黃素含量的可能優(yōu)化方式.模擬結(jié)果顯示,催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為番茄紅素的代謝途徑中相關(guān)酶的活力較低,可能是限制小球藻細(xì)胞中葉黃素含量提

8、高的瓶頸. (5)對(duì)發(fā)酵罐中異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻細(xì)胞的流變學(xué)特性的研究結(jié)果顯示,在小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的表觀黏度值較低且變化不明顯,提示培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有或極少有增加培養(yǎng)液黏度的物質(zhì)分泌.對(duì)濃縮的小球藻懸浮液的流變學(xué)研究表明,當(dāng)小球藻細(xì)胞濃度低于150g/1時(shí),小球藻懸浮液呈現(xiàn)牛頓流體特性,黏度較低(<40 mPa·s),且隨著細(xì)胞濃度的提高緩慢增加;當(dāng)小球藻細(xì)胞濃度繼續(xù)提高時(shí),小球藻懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)榉桥ｎD流體特性,且黏度隨著細(xì)胞濃度

9、的增加而急劇上升.從流變學(xué)的角度考慮,小球藻是一種適合于高密度培養(yǎng)的微藻,在150g/l細(xì)胞濃度以下其流變學(xué)特性不會(huì)成為高效培養(yǎng)體系的障礙. (6)對(duì)于采用超臨界CO<,2>流體萃取小球藻中葉黃素的可行性進(jìn)行了初步探討,對(duì)萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間以及攜帶劑等重要操作參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究.當(dāng)采取萃取壓力25 MPa,萃取溫度50℃,添加50﹪的乙醇作為攜帶劑,萃取4h時(shí),葉黃素的提取效率達(dá)到87﹪.萃取物的HPLC分析結(jié)果顯示,