肝星狀細(xì)胞活化在早期放射性肝損傷中的作用.pdf

1、[背景與目的]
　　我國(guó)肝癌發(fā)病率很高，放射治療是不能手術(shù)切除肝癌治療的有效手段之一。放射性肝病(radiation-inducedliverdisease，RILD)是制約肝內(nèi)腫瘤劑量遞增的主要因素。RILD形成的具體機(jī)制仍不明確，越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示放射誘導(dǎo)肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞的損傷可能在RILD發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)在肝臟化學(xué)或

2、物理?yè)p傷中的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)參與肝臟的損傷修復(fù)。放射誘導(dǎo)HSC活化情況及其在RILD中作用，目前相關(guān)報(bào)道還比較少。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是RILD發(fā)病中研究較多關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，TGF-β1一方面刺激HSC的活化，另一方面也是HSC活化后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要因子。本實(shí)驗(yàn)擬探討放療對(duì)HSC活化的影響及其與早期RILD的相關(guān)性，并試通過(guò)Ⅱ型TGF-β受體阻斷TGF-β1信號(hào)通路觀察其對(duì)RILD的影響，探索

3、減輕或預(yù)防RILD的可行方案。
　　[材料與方法]
　　1.體外實(shí)驗(yàn)：HSC-T6細(xì)胞株，分為照射組與對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)照射，照射組細(xì)胞單次照射30Gy，分別于照射后24、48、72小時(shí)取標(biāo)本。刮取細(xì)胞檢測(cè)目的基因α-SMA的mRNA，ELISA方法觀察細(xì)胞培養(yǎng)液變化。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及放射性肝損傷模型的建立：雄性SD大鼠70只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組共3組，RILD模型組大鼠肝臟局部電子線照射建模，干預(yù)

4、組為照射并使用攜TGF-βRII可溶性重組腺病毒腹腔注射1ml(1×1011)病毒數(shù)，對(duì)照組無(wú)照射無(wú)干預(yù)。于放療后4周、6周分別取材。顯微鏡下觀察照射野內(nèi)肝組織病理切片，HE染色統(tǒng)計(jì)RILD損傷程度評(píng)分，同時(shí)免疫組織化學(xué)染色觀察各組標(biāo)本α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、TGF-β1、纖連蛋白(FN)、Ⅰ型膠原蛋白(Col-I)的表達(dá)量，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法觀察TGF-β1、FN表達(dá)情況，WesternBlotting檢測(cè)各組α-SMA、F

5、N、Ⅰ型膠原蛋白(Col-I)表達(dá)量。
　　[結(jié)果]
　　1.體外實(shí)驗(yàn)HSC-T6細(xì)胞株：
　　照射組照射后48、72小時(shí)，與對(duì)照組比較，α-SMA的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)；照射組72小時(shí)與48小時(shí)對(duì)比，α-SMA表達(dá)也上調(diào)(P<0.05)。照射組照射后24小時(shí)與對(duì)照組對(duì)比，α-SMA的mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。ELISA檢測(cè)照射組照射后48、72小時(shí)，TGF-β1濃度均較對(duì)照組TGF-

6、β1濃度升高(P<0.05)。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)SD大鼠：照射后4周、6周模型組大鼠肝臟中均見(jiàn)到不同程度的肝細(xì)胞及小葉結(jié)構(gòu)破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為急性炎癥反應(yīng)。照射后4周、6周干預(yù)組急性炎癥反應(yīng)程度較模型組為輕。RILD病理評(píng)分，照射后4周時(shí)模型組與干預(yù)組病理評(píng)分均較對(duì)照組升高，6周時(shí)模型組病理評(píng)分均較4周組模型組升高，而6周時(shí)干預(yù)組較模型組相比病理評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化觀察統(tǒng)計(jì)顯示照射后4周、6周

7、時(shí)模型組的TGF-β1、α-SMA、FN及Col-I表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，干預(yù)組的α-SMA、TGF-β1、FN及Col-I表達(dá)較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR提示：照射后4周和6周，模型組、干預(yù)組的TGF-β1、FN的mRNA表達(dá)較對(duì)照組均有升高，照射后4周和6周的干預(yù)組FN的mRNA表達(dá)均較模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WesternBlotting結(jié)果示照射后6周，干預(yù)組的α-SM