瘤胃硝酸鹽偶聯(lián)型厭氧甲烷氧化菌及NC10門多樣性研究.pdf

1、反芻動物CH4排放會造成能量損失和溫室效應，硝酸鹽可有效降低CH4排放，同時為反芻動物提供氮源。目前認為，其降低甲烷排放的機制是其代謝產物亞硝酸鹽對產甲烷菌的抑制作用，以及其消耗氫因而減少了產甲烷菌的底物。本研究推測瘤胃中可能同時存在甲烷厭氧氧化偶聯(lián)反硝化(DAMO)細菌、DAMO古菌和氨基氧化菌，即硝酸鹽可促進甲烷厭氧氧化從而降低了瘤胃CH4排放。本試驗首先檢測了添加硝酸鹽和銨鹽對短期發(fā)酵甲烷排放和微生物結構的影響，并在此基礎上研究以

2、甲烷為唯一碳源對瘤胃中可能存在的硝酸鹽依賴型厭氧甲烷氧化菌進行富集培養(yǎng)，揭示瘤胃中硝酸鹽及亞硝酸鹽依賴型厭氧甲烷氧化菌多樣性，為安全利用硝酸鹽降低甲烷排放提供研究基礎。試驗包括三部分:
　　試驗一添加硝酸鹽和銨鹽對體外瘤胃液培養(yǎng)體系甲烷排放及微生物結構的影響
　　本試驗旨在研究瘤胃液體外培養(yǎng)體系中是否存在已發(fā)現(xiàn)的DAMO相關細菌、古菌和氨基氧化菌，并分析添加硝酸鹽是否會促進DAMO相關微生物的增殖從而降低CH4排放。試驗分別

3、添加5mmol/LNaNO3、4mmol/LNH4C1以及兩者混合添加對瘤胃短期發(fā)酵氣體體積、CH4總產量、發(fā)酵參數(shù)、硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度、干物質降解率、總菌數(shù)量和產甲烷菌、NC10門細菌、ANME-2d古菌和氨基氧化菌相對總菌比例的影響。結果顯示:1）添加硝酸鹽、銨鹽組和混合添加對培養(yǎng)體系中pH、揮發(fā)性脂肪酸、干物質降解率、中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率、亞硝酸鹽濃度和總菌數(shù)量均無明顯影響(P＞0.05)，均顯著提高了氨態(tài)氮濃

4、度(P＜0.05)，并顯著降低發(fā)酵氣體總產量(P＜0.05);2)硝酸鹽組顯著提高了發(fā)酵液中硝酸鹽的濃度(P＜0.05)，而同時添加硝酸鹽和銨鹽對發(fā)酵液中的硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度無影響(P＞0.05);3)添加硝酸鹽和混合添加可顯著降低CH4體積以及產甲烷菌相對總菌的比例(P＜0.05);4)特異引物PCR檢測顯示，瘤胃中存在NC10，且添加硝酸鹽和混合添加顯著提高了NC10門相對總菌的比例(P＜0.05);5)采用ANME-2d和氨基氧

5、化菌特異引物PCR未檢測到DAMO古菌和氨基氧化菌。
　　試驗二瘤胃液中硝酸鹽偶聯(lián)甲烷厭氧氧化菌多樣性研究
　　本試驗利用16s rDNA高通量測序技術分析了分別添加5mmol/LNaNO3、4mmol/LNH4Cl以及兩者混合添加對富集培養(yǎng)11個月過程中體系微生物菌群結構的影響，分析了可能存在的硝酸鹽依賴型甲烷氧化菌菌屬組成，并利用同位素(13CH4)標記方法檢測培養(yǎng)體系是否存在甲烷厭氧氧化過程。結果顯示，富集培養(yǎng)體系存在

6、甲烷厭氧氧化過程。富集培養(yǎng)過程使瘤胃液中的優(yōu)勢菌門擬桿菌門由56.73％最終降低到0.25-0.85％，銨鹽組厚壁菌門豐度由40.57％最終降低到2.44％，硝酸鹽、銨鹽和混合組變形菌門豐度分別由1.18％提高到89.41％、51.13％和69.41％，其中OTU1(屬于Paracoccus)和OTU2(屬于Phenylobacterium)等成為富集培養(yǎng)體系中的優(yōu)勢菌群，富集培養(yǎng)后其豐度范圍分別為0.08％-53.22％和0.1％-1

7、9.01％，并使瘤胃微生物區(qū)系的菌種數(shù)量分別降低到288、322和179個;隨著富集培養(yǎng)，體系中OTU5（屬于Methanobacterium）豐度由未檢測到分別升高到5.81％(A04)、4.95％(B06)和9.1％(C09)。本次試驗采用通用引物進行高通量測序未檢測到瘤胃中存在NC10門和氨基氧化菌。富集培養(yǎng)體系不存在ANME-2d。
　　試驗三16srDNA序列分析法檢測奶山羊瘤胃液中NC10的多樣性
　　試驗一通過

8、特異引物PCR檢測到瘤胃液中存在NC10門，但試驗二利用推薦的通用引物對原始瘤胃液及富集培養(yǎng)液中菌群進行高通量測序卻未檢測到NC10門，說明目前推薦的通用引物存在局限性。鑒于此，利用NC10特異引物對瘤胃液菌群進行了16srDNA分析，以檢測瘤胃液中NC10門的組成。結果表明，瘤胃液中NC10門菌種存在多樣性，一共檢測到了8個OTU與M.oxyfera屬于同一分枝，但16s rDNA序列相似性不高于87％。
　　綜上，添加硝酸鹽可

9、促進瘤胃液體外發(fā)酵體系中NC10門細菌的增殖，并因此降低了甲烷排放;同時添加硝酸鹽和銨鹽可加速硝酸鹽的還原和亞硝酸鹽的代謝。富集培養(yǎng)體系中存在甲烷厭氧氧化過程，富集培養(yǎng)后體系中的優(yōu)勢菌門為變形菌門，這些優(yōu)勢菌中有能夠氧化甲烷和還原硝酸鹽的菌屬，推測其為瘤胃液中的硝酸鹽偶聯(lián)型厭氧甲烷氧化菌;特異引物PCR和16s rDNA高通量測序均未檢測到DAMO體系中的古菌ANME-2d。瘤胃液中存在NC10多樣性。根據(jù)富集培養(yǎng)中微生物區(qū)系組成可以推