多壁碳納米管的免疫學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、納米技術(shù)的進(jìn)步正在對(duì)醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用,迄今為止,在納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有諸多納米材料被廣泛研究,以探索其在疾病早期診斷和有效治療方面的應(yīng)用潛能。在眾多的納米材料中,碳納米管是最具吸引力的納米材料之一。碳納米管具有獨(dú)特的物理和化學(xué)特性,表面可以被化學(xué)修飾,并進(jìn)一步與藥物、蛋白、基因等物質(zhì)相結(jié)合,用于疾病的診斷與治療。碳納米管作為一種外源性異物進(jìn)入機(jī)體時(shí),首先面對(duì)的是機(jī)體的免疫系統(tǒng),碳納米管的免疫學(xué)效應(yīng)是決定其臨床應(yīng)用安

2、全性的首要因素之一,人們對(duì)納米粒子與免疫系統(tǒng)作用的了解還處于初級(jí)階段,碳納米管的免疫效應(yīng)與其分散狀態(tài)、使用形式、應(yīng)用濃度等多種因素有關(guān),因此,對(duì)不同種類的碳納米管需要分別進(jìn)行研究。
　　 本論文的研究工作主要包括以下方面:
　　 (1)基于實(shí)驗(yàn)室以往建立的碳納米管表面處理技術(shù),利用超聲與混合濃酸相結(jié)合的氧化方法制備了在水溶液中能夠穩(wěn)定分散的多壁碳納米管(MWCNTs),采用掃描電鏡、動(dòng)態(tài)光散射、表面能譜、紅外光譜等進(jìn)行理

3、化性質(zhì)表征,并建立了水溶液中MWCNTs的定量方法。
　　 (2)研究了皮下注射MWCNTs在正常小鼠體內(nèi)引起的免疫響應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)。利用病理學(xué)和免疫組化分析方法觀察了碳納米管的體內(nèi)分布及對(duì)組織器官的影響,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)和蛋白芯片技術(shù)研究了碳納米管對(duì)小鼠補(bǔ)體系統(tǒng)的活化和外周血中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響,應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)研究了外周血中淋巴細(xì)胞亞群分布的變化,應(yīng)用血液生化分析技術(shù)檢測(cè)了小鼠的肝、腎功能變化。

4、>　　 (3)研究了皮下注射MWCNTs所引起的免疫學(xué)效應(yīng)對(duì)腫瘤免疫治療的潛在應(yīng)用價(jià)值。在荷瘤小鼠模型上研究了MWCNTs對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的活化和誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá),通過腫瘤生長(zhǎng)曲線觀察了MWCNTs通過免疫刺激作用而產(chǎn)生的對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 (4)以牛血清白蛋白(BSA)作為模型分子,研究了MWCNTs對(duì)蛋白質(zhì)分子的作用。在研究MWCNTs對(duì)BSA吸附作用的同時(shí),探討了MWCNTs對(duì)水溶液中未被吸附的BSA分子結(jié)構(gòu)

5、的影響,采用紅外圓二色譜(CD)檢測(cè)了BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的變化,用原子力顯微鏡(AFM)觀察了BSA空間結(jié)構(gòu)的改變,用等電聚焦電泳(IEF)分析了BSA等電點(diǎn)的變化,同時(shí)用電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)譜(MOLD-TOF-MS)測(cè)定了BSA的分子量。
　　 (5)檢測(cè)了經(jīng)過不同條件處理的碳納米管樣品中內(nèi)毒素的水平,探討鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的方法對(duì)碳納米管的可適用性。
　　 取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)注射的

6、MWCNTs大部分在皮下注射部位蓄積,并招募大量巨噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞噬；少部分吞噬了MWCNTs的巨噬細(xì)胞隨循環(huán)系統(tǒng)遷移到淋巴結(jié)內(nèi),三個(gè)月后仍可觀察到,但沒有引起明顯的炎癥反應(yīng)；在心、肝、脾、腎等臟器中沒有觀察到MWCNTs的明顯蓄積,上述臟器表現(xiàn)的炎癥反應(yīng)在注射1周后逐漸減弱,1個(gè)月后臟器組織回復(fù)到正常組織狀態(tài),未發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)或肉芽腫的形成,主要臟器沒有發(fā)生明顯的病變。
　　 (2)皮下注射的MWCNTs會(huì)引起正常小鼠補(bǔ)體系

7、統(tǒng)的活化和炎性細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào):注射后2天,補(bǔ)體成分C3明顯降低,C5a水平顯著升高,40種炎性細(xì)胞因子中的絕大部分均有不同程度的明顯升高。上述效應(yīng)具有明顯的時(shí)間依賴性,在注射1周后逐步回復(fù)到正常水平。
　　 (3)在荷瘤鼠模型上,皮下注射的MWCNTs起到了一定的免疫刺激作用,表現(xiàn)為:補(bǔ)體成分C3顯著降低、巨噬細(xì)胞大量吞噬碳納米管、炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平升高、MHCII表達(dá)升高和B淋巴細(xì)胞數(shù)量增加。結(jié)果表明,機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)腫

8、瘤的免疫反應(yīng)。同時(shí),從腫瘤生長(zhǎng)曲線觀察到腫瘤的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。
　　 (4)碳納米管對(duì)BSA有瞬間吸附和動(dòng)態(tài)吸附的作用,同時(shí)對(duì)于溶液體系中未被吸附的蛋白,碳納米管對(duì)其結(jié)構(gòu)也有一定的影響:其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成中β-折疊減少,β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋增加,這導(dǎo)致了其空間構(gòu)型發(fā)生了變化,同時(shí)使其等電點(diǎn)向堿性端移動(dòng)。
　　 (5)碳納米管的分散會(huì)對(duì)鱟試劑檢測(cè)過程產(chǎn)生干擾,分散效果好的碳納米管會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性,提示需要用多種方法