脂質(zhì)和糖對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變及內(nèi)皮細(xì)胞NO、NOS和PDGF-B表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分高脂喂養(yǎng)對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變病理改變的影響 目的：觀察高脂喂養(yǎng)對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變病理改變的影響，以期探討血脂異常在DR發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：建立糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為四組：(A)非糖尿病大鼠+普通飼料喂養(yǎng)組；(B)非糖尿病大鼠+高脂飼料喂養(yǎng)組；(C)糖尿病大鼠+普通飼料喂養(yǎng)組；(D)糖尿病大鼠+高脂飼料喂養(yǎng)組。分別進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片、石蠟切片及透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。 結(jié)果：(1)視網(wǎng)膜血管鋪片：A

2、、B組未見(jiàn)異常改變，C組可見(jiàn)閉塞的無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管，周細(xì)胞數(shù)量減少，D組病變最為嚴(yán)重，可見(jiàn)多數(shù)閉塞的無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管及毛細(xì)血管無(wú)灌注區(qū)，周細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。(2)HE染色切片：A、B組未見(jiàn)異常改變；C組可見(jiàn)視網(wǎng)膜增厚，尤其內(nèi)叢狀層和視桿、視錐細(xì)胞層；D組病變最明顯，細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)核層血管周圍水腫，節(jié)細(xì)胞排列不規(guī)則，數(shù)目減少，靜脈擴(kuò)張、滲出，出血。(3)透射電鏡觀察：A、B組未見(jiàn)異常改變；C組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管基底膜輕度增

3、厚；D組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞核異染色質(zhì)濃集、居邊，線粒體腫脹變性，甚至呈空泡狀，管腔狹窄，視細(xì)胞外節(jié)盤(pán)膜結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹。 結(jié)論：食餌性高脂血癥對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變病理改變的進(jìn)程有非常重要的作用，提示高脂血癥在DR的發(fā)生中起促進(jìn)作用。 第二部分脂質(zhì)和糖參與糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制的研究 第一章 LPC和糖對(duì)牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞N0及NOS表達(dá)的影晌 目的：研究溶血磷脂酰膽堿(Lysophospha

4、tidylcholine，LPC)和糖對(duì)牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Bovine retinal endothelial cell，BRECs)NO和NOS生成的影響，為進(jìn)一步闡明脂毒性在DR發(fā)生中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，差速黏附法純化BRECs。培養(yǎng)的BRECs分三組：第一組：加入不同濃度的LPC(0.60umol/L)；第二組：加入不同濃度葡萄糖(5，6、30 mmol/L)和甘露醇(20mm

5、ol/L)；第三組：加入LPC(60umol/L)和高糖(30 mmol/L)。用NO和NOS試劑盒檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量和NOS活性，RT-PCR法檢測(cè)eNOS mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果：①LPC(60umol/L)作用BRECs 24h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)基中NO含量、NOS活性和細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)水平較低(P<0.05)；②高糖(30mmol/L)作用BRECs 24h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)

6、液中NO濃度、NOS活性和細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)水平下降P<0.01)，相同滲透壓的甘露醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度和NOS活性無(wú)影響(P>0.05)；③LPC(60umol/L)和葡萄糖(30mmol/L)共同作用BRECs 24h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量、NOS活性和細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。 結(jié)論：LPC和高糖分別單獨(dú)作用能夠降低牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO和NOS的表達(dá)水平，且兩種因素有

7、協(xié)同作用，這可能是脂代謝紊亂參與DR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。 第二章 LPO和糖對(duì)牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-B表達(dá)的影響 目的：研究LPC和糖對(duì)BRECs表達(dá)PDGF-B的影響，為進(jìn)一步闡明脂代謝紊亂在DR發(fā)生發(fā)展中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：原代培養(yǎng)的BRECs分三組：第一組：加入不同濃度的LPC(0.60umol/L)；第二組：加入不同濃度葡萄糖(5.6、30mmogL)和甘露醇(20mmol/L)；

8、第三組：加入LPC(60umol/L)和高糖(30 mmol/L)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PDGF-B蛋白的含量，RT-PCR法檢測(cè)PDGF-B mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果：①LPC(60umol/L)作用BRECs 12h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)液中PDGF-B含量和細(xì)胞PDGF-BmRNA的表達(dá)水平增加(p<0.01)；②高糖(30mmol/L)作用BRECs 24h后，與對(duì)照組比較，細(xì)

9、胞培養(yǎng)液中PDGF-B含量和細(xì)胞PDGF-BmRNA的表達(dá)水平增加(P<0.05)，相同滲透壓的甘露醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)；③LPC(60 umol/L)和葡萄糖(30mmol/L)共同作用BRECs 12h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中PDGF-B的含量和細(xì)胞PDGF-BmRNA的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)。 結(jié)論：LPC和高糖分別單獨(dú)作用能夠增加牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-B的表達(dá)水平，且兩種因素