應(yīng)用DGGE技術(shù)研究低分子量聚乙烯粉末對土壤細(xì)菌遺傳多樣性的影響.pdf

1、隨著我國農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，中國農(nóng)用塑料薄膜產(chǎn)量整體保持穩(wěn)步增長的態(tài)勢，但隨之而來的一個問題就是如何處理這些使用過后的農(nóng)用塑料薄膜。在國家大力推行環(huán)境保護(hù)的背景下，要求我們走綠色、環(huán)保之道，因此，可降解農(nóng)用塑料薄膜的研究成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的一項(xiàng)重大任務(wù)。在自然狀況下環(huán)境降解地膜能夠在較短的時間內(nèi)碎片化，并能夠進(jìn)一步有殘碎片降解為分子量更低的粉末狀或顆粒狀殘留物。這類殘留物仍然具有極強(qiáng)的疏水性，在短時間內(nèi)很難被完全降解掉。因此，這些降解后的

2、殘留物對土壤生態(tài)系統(tǒng)有什么樣的影響就成了一個新的課題。本研究就在這樣一個新課題中產(chǎn)生的。對于這樣一個課題，前人有少量研究，且是關(guān)于這些殘留物對土壤中農(nóng)作物的影響。土壤微生物多樣性是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，因此研究這些殘留物對土壤微生物多樣性的影響就成了一項(xiàng)重要課題。
　　本研究中，首先利用添加有低分子量聚乙烯(LMWPE)粉末的土壤進(jìn)行農(nóng)作物盆栽試驗(yàn)。然后利用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)研究低分子量聚乙烯粉末對盆栽

3、土壤微生物多樣性的影響。通過以上方式來模擬農(nóng)膜降解殘留物在農(nóng)田中的分布情況以及農(nóng)膜殘留物對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物多樣性的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，分別向盆栽土壤中添加3種分子量的LMWPE(2000，5000，100000)，且每種分子量LMWPE含有5種不同累積量（1年，5年，10年，50年，100年）的處理為實(shí)驗(yàn)組。另外，以栽培有農(nóng)作物的土壤中不加入LMWPE的處理作為空白對照組(CK)，共得到16個處理，每個處理設(shè)置3個平行。其中分別以2

4、K，5K，10W作為3種LMWPE分子量的簡稱。每種LMWPE累積量的具體含義為，每千克土壤中累積殘留聚乙烯粉末的重量。其對應(yīng)的具體值分別為0.04241g·kg-1、0.21205g·kg-1、0.4241g·kg-1、2.1205g·kg-1和4.2410g·kg-1，分別用1Y，5Y，10Y，50Y，100Y作為5種LMWPE累積量的簡稱。所有16個處理的簡稱分別為CK,2K1Y,2K5Y,2K10,2K50Y,2K100Y,5K

5、1Y,5K5Y,5K10Y,5K50Y,5K100Y,10W1Y,10W5Y,10W10Y,10W50Y,10W100Y。
　　本文將分三個部分對整個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡述:
　　(1)首先根據(jù)小白菜的不同生長時期（定植后第21天、第35天）對添加有LMWPE的土壤樣品進(jìn)行分批次采集，共采集了2批土樣。即第1批次樣品為定植后第21天采集的土樣，共16個處理的樣品;第2批次樣品為定植后第35天采集的土樣，共16個處理的樣品。每個土樣經(jīng)冷

6、凍真空干燥后進(jìn)行提取土壤總DNA的提取與檢測。
　　(2)通過對PCR Taq MasterMix的篩選、添加的合適PCR輔助劑以及在16SrDNA v3區(qū)基因片段擴(kuò)增過程中降落PCR的應(yīng)用及優(yōu)化，得到了特異性高，條帶單一的滿足DGGE需求的PCR片段。
　　(3)在30％和60％濃度的變性劑組合及80v12h的電泳條件下進(jìn)行DGGE，經(jīng)合適的銀染步驟得到DGGE指紋圖譜。然后采用Bio-Rad公司的Quantity One

7、軟件對DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析，相似性分析和聚類分析。分析結(jié)果如下:
　　1)在土壤微生物多樣性方面，第1、2批次添加有不同LMWPE的各個土樣中，土壤微生物群落均有較高的豐富度指數(shù)，多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)。
　　2)在添加有不同LMWPE的各個土樣中，第1批次和第2批次內(nèi)不同處理土樣細(xì)菌群落間的相似度都較高，都超過了60％。不同實(shí)驗(yàn)組之間，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間無特定的分類規(guī)律，且差異性不大。
　　通過最終分析，利用DG